NGF تسليمها إلى الدماغ هو التحدي. هنا نقدم نوع جديد من الناقل الذي يسمح لإطلاق سراح آمن وطويل من البروتين النشط بيولوجيا. هذه التقنية تسمح بسيطة وفعالة تحميل NGF في ناقلات السيليكون المسامية.
ويتم ذلك في درجة حرارة الغرفة ودون استخدام المذيبات العضوية القوية. كما تصميم الناقل السيليكون مسامية هو قابل للتواؤم الناقلين يمكن أن تكون بمثابة زرع خزان NGF لإطلاق سراح على المدى الطويل ولكن يمكن أيضا أن تعدل لتحمل عوامل أخرى والمخدرات. بالنسبة للمهندسين والكيميائيين، قد يكون من الأسهل تنفيذ عملية التصنيع.
بينما بالنسبة لعلماء الحياة والأطباء، ينبغي أن تكون إجراءات زراعة الخلية مباشرة نسبياً للتكاثر. تبدأ من خلال تركيب نقطة واحدة خمسة في نقطة واحدة خمسة سم رقاقة السيليكون مع مقاومة تتميز بشكل جيد في خلية النقش الإكالين polytetrafluro باستخدام شريط من رقائق الألومنيوم ك التماس الخلفي و o-حلقة لختم الخلية. النسيج هو reresistable لاستخدام رقائق السيليكون مع قيم مقاومة مماثلة في كل مرة.
كهربائياً كيميائياً حفر عينة السيليكون في محلول ثلاثة إلى واحد من حمض الهيدروفلوريك akleus والإيثانول لمدة 20 ثانية في كثافة تيار ثابت من 250 مللي amp في تربيع. ثم شطف سطح فيلم السيليكون المسامية الناتجة مع الإيثانول ثلاث مرات قبل التجفيف تحت تيار النيتروجين. عندما تكون العينة جافة، تتأكسد حراريا عينة السيليكون المسامية المحفورة حديثا في فرن الأنبوب عند 800 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة في الهواء المحيط لتشكيل سقالة السيليكون المسامية المؤسدة.
عندما تبرد العينة، استخدم منشار ة لقطعها إلى عينة من ثمانية في ثمانية ملليمترات. لتحميل العينات مع NGF، الاستغناء 52 ميكرولترات من حل تحميل NGF الطازجة على رأس كل عينة واحتضان العينات لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة في طبق مغطى في ظل ظروف الرطوبة العالية. بعد ساعتين، وجمع الحل على رأس العينات وتمييع حل التحميل NGF وجمع عينات حل تحميل آخر إلى نطاق التركيز المناسب لمجموعة الاليزا.
عندما تم تخفيف جميع العينات، إضافة 100 ميكرولترات من العينات المخففة في عينات منحنى المعايرة إلى كل بئر من الأجسام المضادة التقاط NGF المغلفة 96 لوحة إيليزا جيدا لمدة ساعتين حضانة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، وغسل لوحة أربع مرات وإضافة مائة ميكرولتر من ميكروغرام واحد لكل ملليلتر من الأجسام المضادة للكشف الحيوي إلى كل بئر لمدة ساعتين حضانة في درجة حرارة الغرفة. بعد أربعة يغسل، كما ثبت إضافة 100 ميكرولترات من Avidin-Horseradish بيروكسيداس إلى كل بئر لاحتضان 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة تليها أربعة يغسل في عازلة الغسيل كما هو موضح.
بعد الغسيل الأخير، إضافة 100 ميكرولترات من محلول الركيزة لكل بئر ل25 دقيقة تطوير اللون الحضانة في درجة حرارة الغرفة. ثم استخدم قارئ microplate لقياس الامتصاص في 405 نانومتر مع تصحيح طول الموجة تعيين في 650 نانومتر وتحديد تركيز NGF في كل من حل التحميل ومحلول التحميل بعد جمعها على أساس منحنى المعايرة. لإطلاق سراح في المختبر NGF، احتضان NGF تحميل ناقلات السيليكون المسامية المؤسدة في ملليلتر من صفر نقطة صفر واحد PBS الضرس تكملها واحد في المئة مصل البامان الصبية في صفر نقطة صفر اثنين في المئة أزيد الصوديوم في 37 درجة مئوية و 100 التناوب في الدقيقة من adjatation المداري.
جمع الحل كل يومين الاستعاضة عنه مع ملليلتر اثنين من برنامج تلفزيوني جديد بعد كل طموح. ثم تجميد عينات الافراج التي تم جمعها في النيتروجين السائل للتخزين ناقص 20 درجة مئوية حتى NGF تحليل من قبل الجيزة كما أظهرت للتو. لتوليد feo 12 أو sitoma 12 12 فيو كرومو ، خلية الثقافة ، وجمع تعليق الخلية عن طريق sentripugation وإعادة تعليق الخلايا في خمسة ملليلتر من متوسطة النمو الأساسية الطازجة.
بعد طاردة ثانية، إعادة تعليق الحنك في ثلاثة ملليلتر من متوسط النمو الأساسي واستخدام حقنة قياس 23 لpireate الخلايا 10 مرات لفصل أي مجموعات الخلايا. بعد عد, بذرة واحدة أوقات 10 إلى الرابعة خلايا لكلّ سنتيمتر [تربيع] عمل منطقة على [كوليجن] نوع واحدة ألواح مكسوة في الوجود من تمايز وسط. ضع اللوحات في الحاضنة.
بعد 24 ساعة في 37 درجة مئوية إضافة جديدة مورين بيتا NGF أو NGF تحميل الناقل السيليكون المسامية إلى كل لوحة والعودة لوحات إلى الحاضنة. لتقييم جدوى الخلية، احتضان الثقافات مع 10 في المئة من حل مؤشر الجدوى المناسبة في نقاط زمنية تمثيلية لمدة خمس ساعات في 37 درجة مئوية وقياس الامتصاص على مقياس الطيف في 490 نانومتر مع تصحيح طول الموجة المحدد في 630 نانومتر. لتقييم تمايز الخلايا PC 12 في وجود NGF تحميل ناقلات السيليكون المسامية، بذور PC 12 الخلايا في 12 لوحات منخفضة الكولاجين المغلفة لمدة 24 ساعة في حاضنة ثقافة الخلية وإدخال عينات التي تم الحصول عليها سابقا في في المختبر إلى الآبار التجريبية المناسبة.
بعد حضانة 24 ساعة، صورة الخلايا عن طريق المجهر الخفيفة، وحص يدويا عدد الخلايا مع alkronurites في كل بئر. للتحليل morphrometric من الخلايا PC 12 متفاوتة الحصول على صور المرحلة من الخلايا المستزرعة تصل إلى ثلاثة أيام بعد العلاج مع NGF وفتح الملفات في J.تحويل ملف الصورة إلى تنسيق ثمانية بت واستخدام شريط مقياس الصورة لقياس نسبة بكسل إلى ميكرومتر. استخدم التحليل واضبط المقياس لتعيين المقياس وقياس طول كل نيوريت.
ثم عد يدويا عدد من نقاط المتفرعة وعدد النوريت من كل خلية سوما. يتم عرض صور المجهر الإلكتروني عالية الدقة للفيلم السيليكون المسامي المؤكد الناتج. ويكشف ميكروجراف عرض أعلى للفيلم عن طبيعته المسامية للغاية مع مسام يبلغ قطرها حوالي 40 نانومتر.
ويكشف ميكروجراف مقطعي عرضي لفيلم مشقوق عن سماكة طبقة مسامية من نقطتين تسع ميكرومترات تتميز بالمسام الأسطوانية المترابطة. ويتم تحقيق إطلاق سراح مستمر من NGF دون تأثير انفجار لمدة شهر واحد مع إصدار أسرع NGF خلال الأسبوع الأول مقارنة بمعدل الإفراج أبطأ بكثير في الأيام اللاحقة من فترة الإصدار. العلاج مع NGF حمل الناقلين السيليكون المسامية يدفع تشكيل نيوريت في شبكات الخلايا العصبية المتفرعة مميزة في الثقافات الخلية PC 12.
لاحظ أنه حتى بعد 26 يوما، وNGF المفرج عنها يحفز تمايز الخلايا من أعلاه 50 في المئة مما يدل على أن شرك NGF داخل المضيف المسامية يحافظ على النشاط البيولوجي للبروتين لفترة من شهر واحد تقريبا. تحليل مورفوميتري لNGF تحميل مجموعات الخلايا المعالجة مسيّسة السيليكون في أيام واحد وثلاثة يكشف أن PC 12 الخلايا المعالجة مع NGF محملة سيليكون مسامية تحمل قيم morphometric مماثلة لتلك التي لوحظت في الثقافات العلاج الخاضعة للرقابة لجميع المعلمات الثلاثة اختبارها. وبعد الوفاء بشكل كاف الخطوات المقدمة سوف توفر لك مع نظام التسليم NGF مفيدة قادرة على الحفاظ على البقاء والتمايز من الخلايا العصبية.
نحن نحقق حاليا في استخدام ناقلات السيليكون المسامية NGF كما الافراج عن يزرع على المدى الطويل في الدماغ لدراسة تأثيرها الوقائي الطبيعي ومعرفة الأمراض التنكسية مثل مرض الزهايمر. بعد هذا الإجراء، يمكن أيضا دراسة تأثير NGF حاملات السيليكون المسامية على النمو الطبيعي للخلايا الغرغرينا الخشبية الزناة. السيليكون المسامية هو مادة نانو واعدة التي يمكن استخدامها لمجموعة واسعة من التطبيقات.
بخلاف تلك المعروضة هنا، بما في ذلك أجهزة الاستشعار البيولوجية أو الكيميائية، والتشخيص، والتصوير. لاستبعاد أي سمية محتملة لناقلات السيليكون المسامية ، نحو خط الخلية الخاص بك ، تأكد من تنفيذ مقال قابلية القطع وتعقيم عينات السيليكون المسامية.
