يصف هذا البروتوكول إعداد وتحليل جهاز استشعار حيوي فريد تم تصميمه للكشف عن المكونات الكيميائية لبقايا الطلقات النارية. واستخدام أجهزة الاستشعار البيولوجية لتطبيقات الطب الشرعي فريد من نوعه. وهو يمثل بديلاً منخفض التكلفة وبسيط الاستخدام للأجهزة عالية التخصص التي تستخدم عادة في مختبرات الطب الشرعي.
يمكن استخدام أساليب البيولوجيا التركيبية الموصوفة لأي نظام يستخدم أجزاء بيولوجية اصطناعية قياسية. التحليل الكيميائي الموصوف ينطبق على أي جهاز استشعار بيولوجي يعبر عن البروتين الفلوري الأحمر. وسيكون إثبات الإجراء أندريا سولس وإيل ريتشاردسون، الطلاب الجامعيين في جامعة لونغوود.
لبدء هذا الإجراء، إضافة عشرة ميكرولترات من الحمض النووي J10060 المعزول سابقا إلى أنبوب microcentrifuge. إضافة ثمانية ميكرولترات من الماء، وميكر واحد من كل من EcoRI وNHEL الإنزيمات مختلطة مسبقا مع ميكرولتر واحد من العازلة. بالنسبة للحمض النووي المروج ، إضافة عشرة microliters من تسلسل الحمض النووي المروج محن إلى أنبوب جديد microcentrifuge.
إضافة ثمانية ميكرولترات من الماء، وميكر واحد من كل من EcoRI وNHEL الإنزيمات مختلطة مسبقا مع ميكرولتر واحد من العازلة. باستخدام ماصة تعيينها إلى عشرة ميكروليترس، ماصة بلطف العينات صعودا وهبوطا لخلط. احتضان العينات في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
ثم، تسخين وتنشط الإنزيمات في 80 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. تخزين الحمض النووي هضم في الثلاجة حتى تصبح جاهزة للشروع. أولاً، استخدم الحمض النووي البلازمي والمروج الذي تم هضمه سابقًا لإعداد التفاعل في أنبوب ميكروستريفوج على الجليد، كما هو موضح في الجدول الأول من بروتوكول النص.
التأكد من إضافة T4 الحمض النووي Ligase الماضي. الماصات صعودا وهبوطا بلطف لخلط رد الفعل، والطرد المركزي لفترة وجيزة. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة عشر دقائق.
ثم، تسخين وتنشيط في 65 درجة مئوية لمدة عشر دقائق. تنفيذ التحويل كما هو موضح في بروتوكول النص. أولاً، إعداد مخاليط التفاعل ل PCR على النحو المبين في الجدول الثاني من بروتوكول النص.
الماصة بلطف صعودا وهبوطا لخلط ردود الفعل. باستخدام طرف ماصة صفراء، كشط مستعمرة من القولونية المتحولة. نقل انتقاد من هذا الإشريكية القولونية على لوحة Agar LB-ampicillin الجديدة التي تم تقسيمها، ومن ثم إدراج تلميح ماصة في أنبوب PCR.
يهز تلميح ماصة لخلط E.Coli مع مزيج PCR. كرر هذه العملية ثلاث مرات إضافية لمستعمرات إضافية. ثم، تحميل أنابيب PCR في جهاز PCR، والبدء في الدراجات الحرارية على النحو المبين في الجدول الثالث من بروتوكول النص.
البدء في تسمية العدد المناسب من أنابيب الثقافة العقيمة كما هو موضح في الجدول الرابع من بروتوكول النص. إضافة ملليلترين من مرق الثقافة المعدة إلى كل أنبوب. إضافة حل الأسهم الanilite إلى الأنابيب على النحو المبين في الجدول الرابع.
ثم، ضع القبعات المفاجئة على أنابيب الثقافة بحيث تكون فضفاضة للسماح تدفق الهواء إلى الأنبوب. دوامة كل أنبوب الثقافة. بعد ذلك، ضع الأنابيب في حاضنة مهزوزة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، و220 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة على الأقل.
أولاً، استخدم مسح الإيثانول المصمم لإزالة الرصاص لمسح جميع أسطح اليدين، بما في ذلك بين الأصابع. تخزين مناديل في حقيبة القابلة للختم المسمى بشكل مناسب حتى التحليل. استخدام الكحول على أساس مسح لمسح أسفل أي الأسطح الكبيرة ليتم اختبارها.
استخدام مبادلة القطن مبللة بالإيثانول لمسح أسفل أي الأسطح الصغيرة ليتم اختبارها. ارتداء قفازات نظيفة واستخدام مقص التي تم تنظيفها مع الكحول، وقطع القسم الذي هو ما يقرب من سنتيمتر مربع واحد من وسط المسح. ثم، ضع قطعة من المسح، أو مسحة القطن، مباشرة في أنبوب الثقافة التي تحتوي على مليلتر اثنين من البكتيريا الاستشعار، وضمان أن تكون مغمورة تماما في مرق.
إعداد المطياف لجمع الفلورسنت في الطول الموجي المناسب لمتغيرات RFP، مع طول موجي مثير من 500 نانومتر. ثم، استخدام خلاط دوامة لهز الأنابيب. نقل بعناية كل افرا إلى cuvette منخفضة الحجم، وجمع كثافة الانبعاثات.
باستخدام خلاط دوامة، يهز الأنابيب. نقل 200 ميكرولترات من المرق إلى بئر في لوحة البئر. سجل العينات التي ذهبت إلى كل بئر من هذه اللوحة.
إعداد مقياس الدقيق لجمع كثافة الانبعاثات عند الطول الموجي المناسب لمتغيرات طلب تقديم العروض. أطياف الفلوريسنس لمتغيرات RFP تمثيلية تظهر كل من التحكم السلبي والأطياف على مستويين مختلفين من الanilite المضافة. ويلاحظ الحد الأقصى للإشارة الفلورية لمتغيرات طلب العروض المستخدمة في هذا العمل عند 575 نانومتر.
يتم جمع البيانات التمثيلية لنفس مجموعة الحلول، من كل من مطياف المحمولة ومقياس الفلور. هناك اتجاه عام من الفلوريسنس زيادة مع زيادة تركيز الanilite. ومن الجدير بالذكر أنه بتركيزات عالية، تزيد عن حوالي 800 جزء في البليون الواحد بالنسبة لأجهزة الاستشعار الرصاصية، تنخفض الاستجابة بسبب سمية الرصاص عند هذا التركيز العالي.
تحليل عينات مسحة الإيثانول من داخل غلاف خرطوشة عيار 40 مستهلك يوفر دليلا على النتائج المبدئية. النتائج الإيجابية لكل من البكتيريا الاستشعار الثلاثة، يشير إلى اختبار إيجابي لبقايا طلقات نارية. ويمكن أيضاً استخدام أجهزة الاستشعار البيولوجية المعدة في هذا البروتوكول بشكل فردي للكشف عن التلوث في عينات الأغذية أو المياه أو البيئة.
تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين لتطوير أجهزة الاستشعار البيولوجية باستخدام تقنيات البيولوجيا الاصطناعية القياسية لمجموعة متنوعة من anilites الكيميائية المختلفة. يجب ارتداء معدات الحماية الشخصية، ويجب على المحللين غسل اليدين وتطهير الأسطح بعد التعامل مع الإشريكية القولونية. وينبغي أن تكون النفايات ذات نفايات ذاتية النفايات، وأن تعالج أي نفايات تحتوي على المعادن الثقيلة وفقاً لذلك.
