Questo protocollo descrive la preparazione e l'analisi di un biosensore unico che è stato progettato per rilevare i componenti chimici dei residui di colpi d'arma da fuoco. L'uso di biosensori per applicazioni forensi è unico. Rappresenta un'alternativa a basso costo, semplice da usare alla strumentazione altamente specializzata tipicamente utilizzata nei laboratori forensi.
I metodi di biologia sintetica descritti possono essere utilizzati per qualsiasi sistema che utilizza parti standard di biologia sintetica. L'analisi chimica descritta è applicabile a qualsiasi biosensore che esprima proteine fluorescenti rosse. A dimostrare la procedura saranno Andrea Soles ed Elle Richardson, studenti universitari della Longwood University.
Per iniziare questa procedura, aggiungere dieci microlitri del DNA plasmide J10060 precedentemente isolato a un tubo di microcentrifugo. Aggiungere otto microlitri di acqua e un microlitri di ciascuno degli enzimi EcoRI e NHEL pre-miscelati con un microlitro di tampone. Per il DNA promotore, aggiungere dieci microlitri di sequenze di DNA del promotore ricotto a un tubo di microcentrifugo fresco.
Aggiungere otto microlitri di acqua e un microlitri di ciascuno degli enzimi EcoRI e NHEL pre-miscelati con un microlitro di tampone. Utilizzando una pipetta impostata su dieci microlitri, pipettare delicatamente i campioni su e giù per mescolare. Incubare i campioni a 37 gradi Celsius per 30 minuti.
Quindi, riscaldare e attivo gli enzimi a 80 gradi Celsius per cinque minuti. Conservare il DNA digerito in un congelatore fino a quando non è pronto per procedere. In primo luogo, utilizzare il DNA plasmide e promotore precedentemente digerito per impostare la reazione in un tubo di microcetrifugo sul ghiaccio, come delineato nella tabella uno del protocollo di testo.
Assicurarsi di aggiungere il T4 DNA Ligase per ultimo. Pipettare su e giù delicatamente per mescolare la reazione e centrifugare brevemente. Incubare a temperatura ambiente per dieci minuti.
Quindi, riscaldare e attivare a 65 gradi Celsius per dieci minuti. Eseguire la trasformazione come descritto nel protocollo di testo. In primo luogo, impostare le miscele di reazione per PCR come indicato nella tabella due del protocollo di testo.
Pipettare delicatamente su e giù per mescolare le reazioni. Usando una punta di pipetta gialla, raschiare una colonia dell'E.coli trasformato. Trasferire uno scorrimento di questo E.coli su una nuova piastra di agar LB-ampicillina che è stata sesata, quindi inserire la punta della pipetta nel tubo PCR.
Agitare la punta della pipetta per mescolare l'E.Coli con il mix PCR. Ripeti questo processo altre tre volte per ulteriori colonie. Quindi, caricare i tubi PCR in una macchina PCR e iniziare il termociclismo come descritto nella tabella tre del protocollo di testo.
Per iniziare etichettare il numero appropriato di tubi di coltura sterile come indicato nella tabella quattro del protocollo di testo. Aggiungere due millilitri del brodo di coltura preparato ad ogni tubo. Aggiungere la soluzione stock di anilite ai tubi come indicato nella tabella quattro.
Quindi, posizionare i tappi a scatto sui tubi di coltura in modo che siano allentati per consentire il flusso d'aria nel tubo. Vortice ogni tubo di coltura. Successivamente, posizionare i tubi in un'incubatrice di scuotimento a 37 gradi Celsius e a 220 giri/min per almeno 24 ore.
In primo luogo, utilizzare una salvietta a base di etanolo progettata per rimuovere il piombo per pulire tutte le superfici delle mani, anche tra le dita. Conservare le salviette in un sacchetto sigillabile opportunamente etichettato fino all'analisi. Utilizzare una salvietta a base alcolica per pulire eventuali superfici di grandi dimensioni da testare.
Utilizzare uno scambio di cotone inumidito con etanolo per pulire eventuali piccole superfici da testare. Indossando guanti puliti e usando forbici che sono state pulite con alcol, tagliare una sezione che è a circa un centimetro quadrato dal centro della salvietta. Quindi, posizionare il pezzo tagliato di salvietta, o batuffolo di cotone, direttamente in un tubo di coltura contenente due millilitri dei batteri del sensore e assicurarsi che sia completamente immerso nel brodo.
Preparare lo spettrometro per raccogliere la sottomissione fluorescente alla lunghezza d'onda appropriata per la variante RFP, con una lunghezza d'onda di eccitazione di 500 nanometri. Quindi, utilizzare un miscelatore a vortice per scuotere i tubi. Trasferire con cura ogni supernatante in una cuvetta a basso volume e raccogliere l'intensità di emissione.
Utilizzando un miscelatore a vortice, agitare i tubi. Trasferire 200 microlitri del brodo in un pozzo nella piastra del pozzo. Registrare quali campioni sono andati in ogni pozzo di questa piastra.
Impostare il flourometro per raccogliere l'intensità di emissione alla lunghezza d'onda appropriata per la variante RFP. Gli spettri di fluorescenza per una variante RFP rappresentativa mostrano sia il controllo negativo che gli spettri a due diversi livelli di anilite aggiunti. Il segnale fluorescente massimo per la variante RFP utilizzata in questo lavoro è osservato a 575 nanometri.
Vengono raccolti dati rappresentativi per lo stesso insieme di soluzioni, sia dallo spettrometro portatile che dal fluorometro. C'è una tendenza generale della fluorescenza che aumenta con l'aumentare della concentrazione di anilite. Vale la pena notare che ad alte concentrazioni, superiori a circa 800 parti per miliardo per il sensore di piombo, la risposta diminuisce a causa della tossicità del piombo a una concentrazione così elevata.
L'analisi dei campioni di tampone di etanolo dall'interno di un involucro a cartuccia di calibro 40 spento fornisce la prova dei risultati principali. I risultati positivi di ciascuno dei tre batteri del sensore indicano un test positivo per i residui di colpi d'arma da fuoco. I biosensori preparati in questo protocollo possono anche essere utilizzati individualmente per rilevare la contaminazione in campioni alimentari, idrici o ambientali.
Questa tecnica apre la strada ai ricercatori per sviluppare biosensori utilizzando tecniche standard di biologia sintetica per una varietà di diversi aniliti chimici. I dispositivi di protezione individuale devono essere indossati e gli analisti devono lavarsi le mani e disinfettare le superfici dopo la manipolazione di E.coli. I rifiuti devono essere autoclavati e tutti i rifiuti contenenti metalli pesanti devono essere trattati di conseguenza.
