Bu protokol, barut kalıntısının kimyasal bileşenlerini tespit etmek için tasarlanmış benzersiz bir biyosensör hazırlanması nı ve analizini açıklar. Adli uygulamalar için biyosensörlerin kullanımı benzersizdir. Genellikle adli laboratuvarlarda kullanılan son derece özel enstrümantasyon alternatif kullanımı basit, düşük maliyetli temsil eder.
Açıklanan sentetik biyoloji yöntemleri standart sentetik biyoloji parçaları kullanan herhangi bir sistem için kullanılabilir. Açıklanan kimyasal analiz, kırmızı floresan proteini ifade eden tüm biyosensörler için geçerlidir. Prosedürü gösteren Andrea Soles ve Elle Richardson, Longwood Üniversitesi'nde lisans öğrencileri olacaktır.
Bu prosedüre başlamak için, bir mikrosantrifüj tüpüne daha önce izole edilmiş J10060 plazmid DNA'sının on mikrolitresini ekleyin. Sekiz mikrolitre su ve EcoRI ve NHEL enzimlerinin her birinin bir mikrolitresini bir mikrolitre tampon mikrolitreile önceden karıştırın. Organizatör DNA için, taze bir mikrosantrifüj tüpüne on mikrolitre annealed organizatör DNA dizisi ekleyin.
Sekiz mikrolitre su ve EcoRI ve NHEL enzimlerinin her birinin bir mikrolitresini bir mikrolitre tampon mikrolitreile önceden karıştırın. On mikrolitreye ayarlanmış bir pipet kullanarak, numuneleri karıştırmak için yavaşça yukarı ve aşağı iniler. Örnekleri 37 derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın.
Sonra, ısı ve 80 santigrat derecede beş dakika boyunca enzimleri aktif. Sindirilmiş DNA'yı devam edene kadar dondurucuda saklayın. İlk olarak, daha önce sindirilmiş plazmid ve organizatör DNA'sını kullanarak, metin protokolünün birinci tablosunda belirtildiği gibi, buz üzerindeki mikrositör tüpünde reaksiyonu ayarlayın.
En son T4 DNA Ligase'yi eklediğinizden emin olun. Pipet yukarı ve aşağı yavaşça reaksiyonu karıştırmak için, ve kısa bir süre santrifüj. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yat.
Sonra, ısı ve 10 dakika boyunca 65 santigrat derecede etkinleştirin. Metin protokolünde özetlenen dönüştürmeyi gerçekleştirin. İlk olarak, metin protokolünün ikinci tablosunda belirtildiği gibi PCR için reaksiyon karışımlarını ayarlayın.
Yavaşça pipet yukarı ve aşağı reaksiyonları karıştırmak için. Sarı pipet ucu kullanarak, dönüştürülmüş E.coli bir koloni kazıyın. Bu E.coli'nin bir kaydırmasını, kesitli yeni bir LB-ampicillin agar plakasına aktarın ve pipet ucunu PCR tüpüne takın.
E.Coli'yi PCR karışımıyla karıştırmak için pipet ucunu sallayın. Ek koloniler için bu işlemi üç kez daha tekrarlayın. Daha sonra, PCR tüplerini bir PCR makinesine yükleyin ve metin protokolünün üçüncü tablolarında belirtildiği gibi termobisiklete başlayın.
Metin protokolünün dördüncü tablosunda belirtildiği gibi uygun sayıda steril kültür tüpünü etiketlemeye başlamak için. Her tüp için hazırlanan kültür suyu iki mililitre ekleyin. Tablo dörtte belirtildiği gibi tüplere anilite stok çözeltisi ekleyin.
Daha sonra, onlar tüp içine hava akışını sağlamak için gevşek böylece kültür tüpleri üzerinde snap kapaklar yerleştirin. Girdap her kültür tüpü. Bundan sonra, tüpleri 37 santigrat derecede ve 220 RPM'de en az 24 saat boyunca sallayarak bir kuluçka makinesine yerleştirin.
İlk olarak, parmaklar arasında da dahil olmak üzere ellerin tüm yüzeylerini silmek için kurşunu kaldırmak için tasarlanmış etanol bazlı bir mendil kullanın. Analiz edilene kadar mendilleri uygun şekilde etiketlenmiş bir mühürlenebilir torbada saklayın. Test edilecek geniş yüzeyleri silmek için alkol bazlı bir silme kullanın.
Test edilecek küçük yüzeyleri silmek için etanol ile nemlendirilmiş bir pamuk takaskullanın. Temiz eldiven ler giyerek ve alkolle temizlenmiş makas lar kullanarak, mendilin ortasından yaklaşık bir santimetre karelik bir kesin. Daha sonra, kesme mendil parçasını veya pamuklu bezi doğrudan sensör bakterilerinin iki mililitresini içeren bir kültür tüpüne yerleştirin ve tamamen et suyuna batırdığından emin olun.
RFP varyantı için uygun dalga boyunda floresan teslimtoplamak için spektrometre hazırlayın, 500 nanometre uyarma dalga boyu ile. Sonra, tüpleri sallamak için bir girdap karıştırıcı kullanın. Her supernatant'ı düşük hacimli bir cuvette'ye dikkatlice aktarın ve emisyon yoğunluğunu toplayın.
Girdap mikseri kullanarak tüpleri sallayın. 200 mikrolitre suyu kuyudaki bir kuyuya aktarın. Bu plakanın her kuyuya hangi örneklerin girdiğini kaydedin.
RFP varyantı için uygun dalga boyunda emisyon yoğunluğunu toplamak için flourometreyi ayarlayın. Temsili bir RFP varyantı için floresan spektrumları, eklenen iki farklı anit düzeyinde hem negatif kontrolü hem de spektrumları gösterir. Bu çalışmada kullanılan RFP varyantı için maksimum floresan sinyal 575 nanometre de gözlenmektedir.
Temsili veriler, hem taşınabilir spektrometreden hem de florometreden aynı çözüm kümesi için toplanır. Anlit konsantrasyonu arttıkça floresan genel bir eğilim artmaktadır. Bu yüksek konsantrasyonlarda, kurşun sensörü için milyarda yaklaşık 800 parçadan daha fazla, tepki gibi yüksek bir konsantrasyonda kurşun toksisitesi nedeniyle düşer dikkati çekiyor.
Harcanan 40 kalibrelik kartuş kasasının içinden alınan etanol bezi örneklerinin analizi, ilke sonuçlarının kanıtını sağlar. Üç sensör bakterisinin her birinden elde edilen pozitif sonuçlar, barut kalıntısı için pozitif bir test olduğunu gösteriyor. Bu protokolde hazırlanan biyosensörler, gıda, su veya çevresel numunelerde kontaminasyonu tespit etmek için ayrı ayrı da kullanılabilir.
Bu teknik, araştırmacıların farklı kimyasal anilitler için standart sentetik biyoloji tekniklerini kullanarak biyosensörler geliştirmelerinin önünü açıyor. Kişisel koruyucu ekipmanlar giyilmeli ve analistler E.coli'yi kullandıktan sonra elleri yıkamalı ve yüzeyleri dezenfekte etmelidir. Atıklar otoklavved edilmeli ve ağır metal içeren atıklar buna göre tedavi edilmelidir.
