بروتوكولنا يمكن أن خريطة جزيء صغير الاتصالات الكيميائية بين الخلايا والأنسجة، ونحن قد طبقت على وجه التحديد هذا لاستكشاف جزيئات صغيرة في ميتاسيس سرطان المبيض. الميزة الرئيسية لتقنيتنا هي القدرة على قياس الجزيئات الصغيرة بطريقة خالية من التسمية مع الحفاظ على السلامة المكانية للخلايا والأنسجة في 2D. وقد سمحت لنا هذه التقنية باستجواب مساهمة الجزيئات الصغيرة في نقائل سرطان المبيض بطريقة غير مستهدفة.
وهذا يمكن أن يكشف عن أهداف علاجية جديدة ومسارات تم تجاهلها في السابق. ويمكن بسهولة توسيع نطاق هذه المنهجية إلى أنواع السرطان الأخرى التي يمكن زراعتها في agarose وأي مرض آخر حيث قد يكون عنصر مكاني مهم للنمط الظاهري الخلوي الناتج. ضمان أن جميع الخلايا والمكونات في متناول اليد والصبر مع عملية التجفيف أمر ضروري لهذا البروتوكول.
يمكن أن تؤدي خطوة الجفاف المتعجلة في كثير من الأحيان إلى بيانات قياس الطيف الكتلي ذات الجودة الرديئة. إن البرهان المرئي لهذه الطريقة مفيد في فهم خطوات إعداد العينة والجفاف لدينا ، حيث تنحرف هذه إلى حد كبير عن تجارب القياس الطيفي الكتلي للتصوير النموذجية التي تستخدم الأنسجة أو الميكروبات على الأجار. للبدء، تسييل agarose في 70 درجة مئوية على لوحة ساخنة.
ضع مقسم ثمانية جيدا على رأس الشريحة المعالجة ITO. عبر العلاج التربسين القياسية، وجمع خلايا وزارة التربية في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر، والطرد المركزي، وإضافة مرة واحدة DMEM وسائل الإعلام إلى إعادة التركيز للحصول على تركيز 50،000 خلية لكل 150 ميكرولترات، وهو ضعف الكثافة النهائية المطلوبة. بالنسبة لثقافات غير مقسمة، استخدم ملقط لإضافة إكسونل المبيض إلى مركز الآبار الأربعة.
قبل الطلاء، والجمع بين 200 ميكرولترات من تعليق الخلية و 200 ميكرولترات من agarose السيل في أنابيب ميلليلتر الفردية. تجنب فقاعات الهواء أثناء الأنابيب. على الفور، إضافة 300 ميكرولترات من خليط الخلايا agarose إلى كل بئر، وتطبيق ضغط هبوطي لطيف مستمر على المقسم لضمان عدم تسرب أو خلط بين الآبار.
تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء والمبيض لا يزال في وسط البئر. إذا كان agarose pipetted إزعاج المبيض، واستخدام بلطف تلميح ماصة لمركز قبل أن يبرد agarose. ثم، احتضان الشريحة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في حاضنة مرطبة.
لثقافات cos مقسمة، وقطع فواصل من رقيقة، والبلاستيك على نحو سلس. وتستخدم جوانب من العقيمة، حوض وسائل الإعلام المتاح. قطع لهم فقط واسعة بما يكفي لتناسب بشكل مريح في وتر البئر.
ضع مقسم الثمانية جيداً على قمة الشريحة المعالجة بـ ITO، وأدخل فواصل البلاستيك قطريًا إلى الآبار. إعداد الثقافات الخلية كما فعلت سابقا، والجمع بين 100 ميكرولترات من تعليق الخلية و 100 ميكرولترات من agarose الهيل في أنبوب ملليلتر اثنين. على الفور، لوحة 150 ميكرولترات من خلية-agarose خليط على جانب واحد من المقسم مع الحفاظ على الضغط النزولي على المقسم.
السماح agarose لتبرد وتتوطد لمدة دقيقة واحدة تقريبا، ثم قم بإزالة المقسم. استخدام ملقط لوضع explant المبيض في وسط النصف الفارغ من البئر. أضف 150 ميكرولترات من خليط الخلايا الأغاروز فوق الجزء العلوي من المبيض.
احتضان الشريحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في حاضنة مرطبة. بعد أربعة أيام، إزالة مقسم الغرفة من المقابس agarose. مع ملعقة مسطحة، فصل الجانبين من agarose من الغرفة، وسحب بلطف الغرفة إلى أعلى.
إذا تم نقل أي المقابس agarose، بلطف إعادة وضعها بحيث أنها لا تلمس بعضها البعض. ضع الشريحة في فرن 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات تقريبًا، وتناوب 90 درجة كل ساعة لضمان توزيع الحرارة حتى في جميع أنحاء العينة. يجب أن تكون الشريحة المجففة تماما.
خلاف ذلك، فإنه يمكن أن يؤدي إلى انفجار العينة في بيئة فراغ عالية من مطياف كتلة MALDI-TOF. تجفيف الشريحة ورصد التقدم المحرز هو الخطوة الأكثر أهمية لتحقيق دقة المكانية العالية ونوعية الأطياف الكتلة. إذا كان القذف أو التجاعيد المفرطة تحدث، فإننا لا ننصح بجمع بيانات قياس الطيف الشامل.
مع المعلمات تعيين على بخاخ المصفوفة، وتطبيق حل مصفوفة على الشريحة. لاستخدام الفسفور الأحمر كما calibrant، إضافة ميكرولتر واحد من الفوسفور الأحمر إلى بقعة واضحة على الشريحة. لاستخدام خليط الببتيد كما calibrant، مزجه مع مصفوفة على Parafilm في نسبة واحد إلى واحد للمساعدة في التأين، وبقعة 0.5 إلى ميكرولتر واحد على الشريحة.
انتظر الكاليبرانت لتجف قبل التقاط بيانات قياس الطيف الشامل للتصوير. رسم X باستخدام علامة دائمة في كل زاوية من زاوية الشريحة، وأخذ صورة بصرية باستخدام كاميرا أو ماسح ضوئي بسرعة 1200 نقطة في البوصة. في هذه التجربة، الرصد الدقيق للشريحة في الفرن أمر ضروري لضمان الشريحة الايلو المجففة الأمثل، مما يؤدي إلى عينة مسطّحة مع الحد الأدنى من التجاعيد إلى لا تجاعيد عبر سطح agarose.
هذا الرقم يبين التجاعيد التي ينبغي تجنبها. يمكن أن تؤثر التجاعيد قليلا على الارتفاع وبالتالي دقة الكتلة من التصوير إشارات الطيف الشامل. التجاعيد الطفيفة لن تؤثر على جودة البيانات.
وينبغي أن يكون نسيج في مكان مثالي أقرب إلى المركز قدر الإمكان. وينبغي أن تكون الأنسجة المستخدمة في وسط البئر إذا كانت غير مقسمة أو في وسط المثلث النصفي إذا كانت مقسمة بحيث لا يكون الحصول على بيانات نظام الرصد الدولي ملوثاً بتأثيرات الحافة. قد يؤدي النسيج المتوضع بشكل سيئ ، عند تصويرها ، إلى إشارات كتلة خاطئة من تأثيرات الحافة.
يتم استخدام صورة الشريحة المجففة لتعليم مطياف كتلة MALDI-TOF الذي المناطق إلى صورة. تم اختيار مناطق صغيرة حول أنسجة المبيض لنظام الرصد الدولي في 50 ميكرومتر. يتم عرض صورة تمثيلية للإشارة m-over-z لثقافات غير مقسمة، وكذلك لإعداد الغرفة المقسمة.
أهم شيء يجب تذكره هو أن البيانات الناتجة فقط جيدة مثل إعداد العينة. إيلاء اهتمام خاص لعملية التجفيف. الجانب الأكثر إثارة هو التحقق من صحة الجزيئات الصغيرة المكتشفة بهذه الطريقة باستخدام تجارب أخرى ، مثل مقايسات الغزو أو مقايسات الاستعمار ، لإعلام حول التركيز الفعال وترجمته إلى علم الأحياء البشري.
ونتوقع أن يفتح هذا الباب لاكتشاف مسارات جديدة من الأهداف العلاجية المحتملة لسرطان المبيض من خلال فهم أفضل للعمليات في التركيب الأولي لسرطان المبيض.
