Notre protocole peut cartographier la communication chimique des petites molécules entre les cellules et les tissus, et nous l’avons spécifiquement appliqué pour explorer de petites molécules dans la métathèse du cancer de l’ovaire. Le principal avantage de notre technique est la capacité de mesurer les petites molécules d’une manière sans étiquette tout en maintenant l’intégrité spatiale des cellules et des tissus en 2D. Cette technique nous a permis d’interroger la contribution des petites molécules dans les métastases du cancer de l’ovaire d’une manière non ciblée.
Cela pourrait dévoiler de nouvelles cibles thérapeutiques et des voies qui ont déjà été négligées. Cette méthodologie pourrait facilement être étendue à d’autres cancers qui peuvent être cultivés dans l’agarose et toute autre maladie dans laquelle un composant spatial pourrait être important pour le phénotype cellulaire résultant. S’assurer que toutes les cellules et composants sont en main et la patience avec le processus de séchage est essentiel à ce protocole.
Une étape de dessiccation précipitée peut souvent conduire à des données de spectrométrie de masse de mauvaise qualité. La démonstration visuelle de cette méthode est utile dans la compréhension de nos étapes de préparation et de dessiccation d’échantillon, car ceux-ci s’écartent considérablement des expériences typiques de spectrométrie de masse d’imagerie qui emploient des tissus ou des microbes sur l’agar. Pour commencer, liquéfier l’agarose à 70 degrés Celsius sur une plaque chaude.
Placez le séparateur de huit puits sur la glissière traitée par l’OIT. Par le traitement standard de trypsine, recueillez des cellules de MOE dans un tube conique de 15 millilitres, centrifugeuse, et ajoutez une fois le média de DMEM à la résuspendance pour obtenir une concentration de 50.000 cellules par 150 microlitres, qui est deux fois la densité finale désirée. Pour les cocultures indivises, utilisez des forceps pour ajouter l’explantation ovarienne au centre des quatre puits.
Juste avant le placage, combiner 200 microlitres de suspension cellulaire et 200 microlitres d’agarose liquéfié dans des tubes individuels de deux millilitres. Évitez les bulles d’air pendant le pipetage. Immédiatement, ajouter 300 microlitres du mélange cellule-agarose à chaque puits, et appliquer une légère pression continue vers le bas sur le séparateur pour s’assurer qu’il n’y a pas de fuite ou de mélange entre les puits.
Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air et que l’ovaire reste au centre du puits. Si l’agarose pipetted dérangé l’ovaire, utilisez doucement la pointe pipette pour le centrer avant que l’agarose refroidit. Ensuite, incubez la glissade à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone dans un incubateur humidifié.
Pour les cocultures divisées, couper les séparateurs de plastique mince et lisse. Les côtés d’un bassin de médias stérile et jetable sont utilisés. Coupez-les juste assez large pour s’insérer confortablement dans l’hypoténuse du puits.
Placez le séparateur de huit puits sur la glissière traitée par l’OIT et insérez les séparateurs en plastique en diagonale dans les puits. Préparez les cultures cellulaires comme cela a été fait précédemment, et combinez 100 microlitres de suspension cellulaire et 100 microlitres d’agarose liquéfié dans un tube de deux millilitres. Immédiatement, plaquez 150 microlitres de mélange cellule-agarose d’un côté du séparateur tout en maintenant la pression vers le bas sur le séparateur.
Laisser refroidir et solidifier l’agarose pendant environ une minute, puis retirer le séparateur. Utilisez des forceps pour placer l’explantation d’ovaire au centre de la moitié vide du puits. Ajouter 150 microlitres de mélange cellule-agarose sur le dessus de l’ovaire.
Incuber la glissade à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone dans un incubateur humidifié. Après quatre jours, retirer le séparateur de chambre des bouchons d’agarose. À l’aide d’une spatule plate, détachez les côtés de l’agarose de la chambre et tirez doucement la chambre vers le haut.
Si des bouchons d’agarose sont déplacés, repositionnez-les doucement afin qu’ils ne se touchent pas. Placez la glissade dans un four de 37 degrés Celsius pendant environ quatre heures et faites pivoter 90 degrés toutes les heures pour assurer une distribution uniforme de la chaleur tout au long de l’échantillon. La lame doit être complètement séchée.
Dans le cas contraire, il peut conduire à une explosion de l’échantillon dans l’environnement à vide élevé du spectromètre de masse MALDI-TOF. Le séchage de la diapositive et la surveillance des progrès sont l’étape la plus critique pour atteindre une haute résolution spatiale et des spectres de masse de qualité. En cas d’écaouillement ou de froissement excessif, nous ne recommandons pas de recueillir les données de spectrométrie de masse.
Avec les paramètres définis sur le pulvérisateur matricielle, appliquer la solution matricielle à la diapositive. Pour utiliser phosphore rouge comme étalon, ajouter un microlitre de phosphore rouge à un endroit clair sur la diapositive. Pour utiliser le mélange peptidique comme étalon, mélangez-le avec la matrice sur Parafilm dans un rapport un-à-un pour faciliter l’ionisation, et placez 0,5 pour un microlitre sur la diapositive.
Attendez que le calibrant sèche avant d’obtenir des données de spectrométrie de masse. Dessinez un X à l’aide d’un marqueur permanent dans chaque coin de la diapositive, et prenez une image optique à l’aide d’un appareil photo ou d’un scanner à 1200 dpi. Dans cette expérience, une surveillance attentive de la lame dans le four est essentielle pour assurer une glissade ITO séchée optimale, ce qui se traduit par un échantillon plat dessiccated avec un minimum ou pas de rides à travers la surface de l’agarose.
Ce chiffre montre les rides qui doivent être évitées. Les rides peuvent légèrement affecter la hauteur et donc la précision de masse des signaux de spectrométrie de masse d’imagerie. De légères rides n’auront pas d’impact sur la qualité des données.
Un tissu situé de façon optimale doit être aussi proche du centre que possible. Le tissu utilisé doit être au centre du puits s’il est indivis ou au centre du demi-triangle s’il est divisé de sorte que l’acquisition de données IMS ne soit pas contaminée par des effets de bord. Les tissus mal positionnés, lorsqu’ils sont photographiés, peuvent entraîner de faux signaux de masse provenant des effets de bord.
L’image de diapositive séchée est utilisée pour enseigner au spectromètre de masse MALDI-TOF quelles régions à l’image. De petites régions autour du tissu ovarien ont été choisies pour ims à 50 micromètres. Une image représentative d’un signal m-over-z est affichée pour les cocultures indivises, ainsi que pour la configuration de chambre divisée.
La chose la plus importante à retenir est que les données qui en résultent ne sont aussi bonnes que la préparation de l’échantillon. Portez une attention particulière au processus de séchage. L’aspect le plus passionnant est la validation des petites molécules découvertes de cette façon à l’aide d’autres expériences, telles que des analyses d’invasion ou des analyses de colonisation, pour informer sur la concentration efficace et traduire en biologie humaine.
Nous nous attendons à ce que cela ouvre la porte à la découverte de nouvelles voies de cibles thérapeutiques potentielles pour le cancer de l’ovaire en comprenant mieux les processus de la métathèse primaire du cancer de l’ovaire.
