Unser Protokoll kann die chemische Kommunikation kleiner Moleküle zwischen Zellen und Geweben abbilden, und wir haben dies speziell angewendet, um kleine Moleküle in der Metathese von Eierstockkrebs zu erforschen. Der Hauptvorteil unserer Technik ist die Fähigkeit, kleine Moleküle etikettenfrei zu messen und gleichzeitig die räumliche Integrität von Zellen und Geweben in 2D zu erhalten. Diese Technik hat es uns ermöglicht, den Beitrag kleiner Moleküle in Eierstockkrebsmetastasen in einer ungezielten Weise zu behördlich zu behördlich zu machen.
Dies könnte neue therapeutische Ziele und Wege enthüllen, die bisher übersehen wurden. Diese Methode könnte leicht auf andere Krebsarten ausgedehnt werden, die in Agarose und jeder anderen Krankheit angebaut werden können, bei der eine räumliche Komponente für den resultierenden zellulären Phänotyp wichtig sein könnte. Sicherstellen, dass alle Zellen und Komponenten in der Hand sind und Geduld mit dem Trocknungsprozess ist wichtig für dieses Protokoll.
Ein überstürzter Austrocknungsschritt kann oft zu qualitativ minderwertigen Massenspektrometriedaten führen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist hilfreich, um unsere Probenvorbereitungs- und Entweibungsschritte zu verstehen, da diese stark von typischen bildgebenden Massenspektrometrieexperimenten abweichen, die Gewebe oder Mikroben auf Agar verwenden. Zunächst die Agarose bei 70 Grad Celsius auf einer Kochplatte verflüssigen.
Platzieren Sie den Acht-Well-Teiler auf der ITO-behandelten Rutsche. Durch Standard-Trypsin-Behandlung, sammeln MOE-Zellen in einem 15-Milliliter konischen Rohr, Zentrifuge, und fügen Sie ein mal DMEM-Medien, um eine Konzentration von 50 000 Zellen pro 150 Mikroliter zu erhalten, das ist zwei Mal die gewünschte Enddichte. Für ungeteilte Kokulturen, verwenden Sie Zangen, um Ovarialexplantation in die Mitte der vier Brunnen hinzuzufügen.
Kurz vor der Beschichtung 200 Mikroliter Zellsuspension und 200 Mikroliter Liquarierteagarose in einzelnen Zwei-Milliliter-Röhren kombinieren. Vermeiden Sie Luftblasen beim Pipetieren. Sofort 300 Mikroliter der Zell-Agarose-Mischung in jeden Brunnen geben und kontinuierlich sanften Abwärtsdruck auf den Teiler ausüben, um kein Auslaufen oder Mischen zwischen Brunnen zu gewährleisten.
Stellen Sie sicher, dass es keine Luftblasen gibt und der Eierstock in der Mitte des Brunnens bleibt. Wenn die pipetierte Agarose den Eierstock gestört hat, verwenden Sie vorsichtig die Pipettenspitze, um sie zu zentrieren, bevor die Agarose abkühlt. Dann inkubieren Sie die Rutsche bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid in einem befeuchteten Inkubator.
Für geteilte Kokulturen, geschnittene Trennwände aus dünnem, glattem Kunststoff. Die Seiten eines sterilen Einweg-Medienbeckens werden verwendet. Schneiden Sie sie gerade breit genug, um eng in die Hypotenuse des Brunnens zu passen.
Legen Sie den Acht-Well-Teiler auf die ITO-behandelte Rutsche und legen Sie Kunststoffteiler diagonal in Brunnen ein. Bereiten Sie Zellkulturen wie bisher vor und kombinieren Sie 100 Mikroliter Zellsuspension und 100 Mikroliter Liquified Agarose in einem Zwei-Milliliter-Rohr. Sofort, Platte 150 Mikroliter Zell-Agarose-Mischung auf einer Seite des Teilers unter Beibehaltung des Abwärtsdrucks auf den Teiler.
Lassen Sie Agarose für etwa eine Minute abkühlen und erstarren, und entfernen Sie dann den Teiler. Verwenden Sie Zangen, um Eierstock-Explantation in der Mitte der leeren Hälfte des Brunnens zu platzieren. 150 Mikroliter Zell-Agarose-Mischung über die Oberseite des Eierstocks geben.
Inkubieren Sie die Rutsche bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid in einem befeuchteten Inkubator. Nach vier Tagen den Kammerteiler aus den Agarose-Steckern entfernen. Mit einem flachen Spachtel die Seiten der Agarose aus der Kammer lösen und die Kammer sanft nach oben ziehen.
Wenn Agarose-Stecker bewegt werden, positionieren Sie sie vorsichtig neu, damit sie sich nicht berühren. Legen Sie die Rutsche für etwa vier Stunden in einen 37-Grad-Celsius-Ofen und drehen Sie jede Stunde 90 Grad, um eine gleichmäßige Wärmeverteilung in der gesamten Probe zu gewährleisten. Die Rutsche muss vollständig getrocknet sein.
Andernfalls kann es zu einer Explosion der Probe im Hochvakuumdes des MALDI-TOF-Massenspektrometers kommen. Das Trocknen des Schlittens und die Überwachung des Fortschritts ist der wichtigste Schritt, um eine hohe räumliche Auflösung und hochwertige Massenspektren zu erreichen. Wenn Abplatzungen oder übermäßige Falten auftreten, empfehlen wir nicht, die Massenspektrometriedaten zu sammeln.
Wenn die Parameter auf dem Matrixsprüher eingestellt sind, wenden Sie die Matrixlösung auf das Dia an. Um Phosphorrot als Kalibrant zu verwenden, fügen Sie einen Mikroliter Phosphorrot an eine klare Stelle auf der Folie hinzu. Um die Peptidmischung als Kalibrant zu verwenden, mischen Sie sie mit Matrix auf Parafilm im Eins-zu-Eins-Verhältnis, um die Ionisierung zu unterstützen, und erkennen Sie 0,5 bis einen Mikroliter auf dem Dia.
Warten Sie, bis der Kalibrant trocken ist, bevor Sie die Datenerfassung der Massenspektrometrie abbilden. Zeichnen Sie ein X mit einem permanenten Marker in jeder Ecke des Dias, und nehmen Sie ein optisches Bild mit einer Kamera oder einem Scanner bei 1200 dpi auf. In diesem Experiment ist eine sorgfältige Überwachung des Schlittens im Ofen unerlässlich, um einen optimalen getrockneten ITO-Schlitten zu gewährleisten, der zu einer flachen ausgetrockneten Probe mit minimalen bis keinen Falten über der Oberfläche der Agarose führt.
Diese Abbildung zeigt die Falten, die vermieden werden sollten. Falten können die Höhe und damit die Massengenauigkeit der bildgebenden Massenspektrometriesignale leicht beeinflussen. Leichte Falten wirken sich nicht auf die Qualität der Daten aus.
Ein optimal gelegenes Gewebe sollte so nah wie möglich am Zentrum sein. Das verwendete Gewebe sollte sich in der Mitte des Brunnens befinden, wenn es ungeteilt ist, oder in der Mitte des halben Dreiecks, wenn es geteilt wird, so dass die Erfassung von IMS-Daten nicht mit Kanteneffekten kontaminiert ist. Schlecht positioniertes Gewebe kann, wenn es abgebildet wird, zu falschen Massensignalen der Kanteneffekte führen.
Das getrocknete Diabild wird verwendet, um dem MALDI-TOF-Massenspektrometer beizubringen, welche Bereiche abbilden. Kleine Regionen um das Eierstockgewebe wurden für IMS mit 50 Mikrometern ausgewählt. Ein repräsentatives Bild eines m-over-z Signals wird für ungeteilte Kokulturen sowie für geteilte Kammeraufbauten dargestellt.
Das Wichtigste ist, dass die resultierenden Daten nur so gut sind wie die Probenvorbereitung. Achten Sie besonders auf den Trocknungsprozess. Der spannendste Aspekt ist die Validierung der kleinen Moleküle, die auf diese Weise mit anderen Experimenten wie Invasions-Assays oder Kolonisationstests entdeckt wurden, um über die effektive Konzentration zu informieren und in die menschliche Biologie zu übersetzen.
Wir erwarten, dass dies die Tür öffnen wird, um neue Wege potenzieller therapeutischer Ziele für Eierstockkrebs zu entdecken, indem wir die Prozesse in der primären Metathese von Eierstockkrebs besser verstehen.
