הפרוטוקול שלנו יכול למפות תקשורת כימית מולקולה קטנה בין תאים ורקמות, ויש לנו במיוחד להחיל את זה כדי לחקור מולקולות קטנות במטאתזה סרטן השחלות. היתרון העיקרי של הטכניקה שלנו הוא היכולת למדוד מולקולות קטנות באופן ללא תווית תוך שמירה על השלמות המרחבית של תאים ורקמות ב- 2D. טכניקה זו אפשרה לנו לחקור את תרומתן של מולקולות קטנות גרורות סרטן השחלות באופן לא מפושט.
זה יכול לחשוף מטרות טיפוליות חדשות ומסלולים כי בעבר התעלמו. מתודולוגיה זו יכולה בקלות להיות מורחבת סרטן אחרים שניתן לגדל אגרוז וכל מחלה אחרת שבה מרכיב מרחבי עשוי להיות חשוב עבור פנוטיפ הסלולר וכתוצאה מכך. הקפדה על כך שכל התאים והרכיבים נמצאים בהישג יד וסבלנות לתהליך הייבוש חיונית לפרוטוקול זה.
צעד ייעוד מהיר יכול לעתים קרובות להוביל נתוני ספקטרומטריית מסה באיכות ירודה. הדגמה חזותית של שיטה זו מסייעת בהבנת ההכנה שלנו לדוגמה וצעדי ייעוד, גם כאשר אלה חורגים במידה רבה מניסויים ספקטרומטריים טיפוסיים במסת הדמיה המשתמשים ברקמות או במיקרואורגניזמים על אגר. כדי להתחיל, להניב את agarose ב 70 מעלות צלזיוס על צלחת חמה.
מקם את המפריד בן שמונה התבונים מעל השקופית שטופלה ב- ITO. באמצעות טיפול טריפסין סטנדרטי, לאסוף תאי MOE בצינור חרוט 15 מיליליטר, צנטריפוגה, ולהוסיף פעם אחת מדיה DMEM כדי resuspend כדי לקבל ריכוז של 50, 000 תאים לכל 150 microliters, שהוא פעמיים את הצפיפות הסופית הרצויה. עבור cocultures מחולק, להשתמש במטליות כדי להוסיף explant השחלות למרכז ארבע בארות.
ממש לפני הציפוי, לשלב 200 microliters של השעיית תאים ו 200 microliters של אגרוז נודאלי בצינורות בודדים שני מיליליטר. הימנע בועות אוויר במהלך צינורות. מיד, מוסיפים 300 מיקרוליטרים של תערובת התא-agarose לכל באר, ולהחיל לחץ עדין מתמשך כלפי מטה על המפריד כדי להבטיח לא דולף או ערבוב בין בארות.
ודא שאין בועות אוויר ואת השחלה נשאר במרכז הבירה. אם הצנרת הפריעה לשחלה, השתמש בעדינות בקצה הפיפיטים כדי למרכז אותה לפני שהתעוררותה תתקרר. לאחר מכן, להדגים את המגלשה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני באינקובטור לח.
לחולקים מחולקים, חותכים את המפרידים מפלסטיק דק וחלק. נעשה שימוש בצידי אגן תקשורת סטרילי וחד פעמי. חותכים אותם רק רחב מספיק כדי להתאים בנוחות לתוך תת לחץ דם של באר.
מניחים את המפריד בעל שמונה התביונות מעל השקופית שטופלה ב- ITO, והכניסו מחיצות פלסטיק באלכסון לתוך בארות. הכינו תרבות תאים כפי שנעשה בעבר, ושלבו 100 מיקרוליטרים של השעיית תאים ו-100 מיקרוליטרים של אגרוז נמרץ בצינור של שני מיליליטר. מיד, צלחת 150 microliters של תערובת תא-agarose בצד אחד של המפריד תוך שמירה על לחץ כלפי מטה על המפריד.
אפשר אגרוז להתקרר ולחזק במשך כדקה אחת, ולאחר מכן להסיר את המפריד. השתמש מדפים למקם explant השחלה במרכז החצי הריק של באר. מוסיפים 150 מיקרוליטרים של תערובת אגרוז תאים מעל השחלה.
להדגים את המגלשה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני באינקובטור לח. לאחר ארבעה ימים, להסיר את מחלק התא מן התקעים agarose. עם מרית שטוחה, לנתק את הצדדים של agarose מהתא, בעדינות למשוך את התא כלפי מעלה.
אם כל תקעים agarose מועברים, בעדינות למקם אותם כך שהם לא נוגעים זה בזה. מניחים את השקופית בתנור 37 מעלות צלזיוס במשך כארבע שעות, ומסובבים 90 מעלות בכל שעה כדי להבטיח חלוקת חום אחידה לאורך המדגם. השקופית חייבת להיות מיובשת לחלוטין.
אחרת, זה יכול להוביל לפיצוץ של המדגם בסביבת ואקום גבוהה של ספקטרומטר מסה MALDI-TOF. ייבוש השקופית וניטור ההתקדמות הוא הצעד הקריטי ביותר להשגת רזולוציה מרחבית גבוהה וספקטרום מסה איכותי. אם מתרחשים מתקלפים או קמטים מוגזמים, איננו ממליצים לאסוף את נתוני ספקטרומטריית המסה.
כאשר הפרמטרים מוגדרים על מרסס המטריצה, החל פתרון מטריצה על השקופית. כדי להשתמש באדום זרחן כמכויל, הוסף מיקרוליטר אחד של זרחן אדום לנקודה ברורה בשקופית. כדי להשתמש בתערובת הפפטיד כמכוילת, ערבבו אותה עם מטריצה על Parafilm ביחס של אחד לאחד כדי לסייע ליינון, ומקום 0.5 למיקרוליטר אחד על השקופית.
המתן עד שהכיול יתייבש לפני הדמיה של נתוני ספקטרומטריית מסה. צייר X באמצעות סמן קבוע בכל פינה של השקופית וצלם תמונה אופטית באמצעות מצלמה או סורק ב- 1200 dpi. בניסוי זה, ניטור זהיר של השקופית בתנור חיוני כדי להבטיח מגלשת ITO מיובשת אופטימלית, וכתוצאה מכך מדגם מיובש שטוח עם מינימום עד ללא קמטים על פני השטח של האגוז.
איור זה מראה את הקמטים שיש להימנע מהם. קמטים יכולים להשפיע מעט על הגובה ולכן דיוק המסה של אותות ספקטרומטריית מסת ההדמיה. קמטים קלים לא ישפיעו על איכות הנתונים.
רקמה הממוקמת בצורה אופטימלית צריכה להיות קרובה ככל האפשר למרכז. הרקמה המשמשת צריכה להיות במרכז באר אם היא מחולקת או במרכז חצי המשולש אם היא מחולקת כך שרכישת נתוני IMS אינה מזוהמת בהשפעות קצה. רקמה ממוקמת רע, כאשר בתמונה, עלול לגרום אותות מסה שווא מן אפקטי הקצה.
תמונת השקופית המיובשת משמשת כדי ללמד את ספקטרומטר המסה MALDI-TOF אילו אזורים דימוי. אזורים קטנים סביב רקמת השחלות נבחרו עבור IMS ב 50 מיקרומטר. תמונה מייצגת של אות m-over-z מוצגת עבור cocultures מחולק, כמו גם עבור הגדרת תא מחולק.
הדבר החשוב ביותר שיש לזכור הוא שהנתונים המתקבלים טובים רק כמו הכנת המדגם. שימו לב במיוחד לתהליך הייבוש. ההיבט המרגש ביותר הוא אימות המולקולות הקטנות שהתגלו בדרך זו באמצעות ניסויים אחרים, כגון מסיאי פלישה או מתנסה קולוניזציה, כדי ליידע על הריכוז היעיל ולתרגם לביולוגיה האנושית.
אנו מצפים כי זה יפתח את הדלת כדי לגלות מסלולים חדשים של מטרות טיפוליות פוטנציאליות לסרטן השחלות על ידי הבנה טובה יותר של התהליכים במטאתזה העיקרית של סרטן השחלות.
