الطبقة 1 هيستون deacetylases مثل RpdA وتناقش كأهداف جديدة محتملة لعلاج العدوى الفطرية. ومع ذلك، هناك حاجة إلى أنشطة انزيم تنقية لمزيد من التوصيف. والميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي الفصل السريع والكافي للمجمعات الأصلية التي توّسم بـ TAP لتحديد النشاط في خطوة واحدة.
يمكن استخدام مجمعات HDAC المستمدة من هذا البروتوكول لفحص فعالية مثبطات الهكتيلاز الفطرية الجديدة. توفر هذه الطريقة الأساس لاستخراج وتنقية البروتينات الفطرية الموسومة بـ TAP ، والتي يمكن استخدامها كنقطة انطلاق لإنشاء بروتوكولات للإنزيمات والسلالات الأخرى. لبدء هذا الإجراء، إضافة 10 ملليلتر من CSS إلى كل قارورة conidia المعدة.
إغلاق بإحكام كل قارورة مع غطاء المسمار المقدمة ويهز بقوة. بعد هذا، استخدام حلقة تطعيم عقيمة لكشط تماما قبالة أي conidia المتبقية. تمرير conidia من خلال مصافي الخلايا 40 ميكرومتر وضعت على أنبوب الطرد المركزي وجمع تعليق من خمسة من القارورة في أنبوب واحد.
ثم الطرد المركزي العينات لدمج وتمييع العينات كما هو مبين في بروتوكول النص. مكان أول مفرش الجبن في قمع على رأس قارورة. تصفية mycelia المعدة من خلال القماش وغسل لفترة وجيزة مع المياه الأيونية.
إزالة أكبر قدر ممكن من الرطوبة من السيلة عن طريق الضغط على قماش الجبن بين أيدي فقط ومن ثم بين المناشف الورقية. بعد هذا، نقل mycelia المجففة كما ورقة مسطحة في منقار من البلاستيك مع غطاء المسمار. باستخدام النيتروجين السائل، فلاش تجميد الوسيلية وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية قبل التجميل.
ثم lyophilize الميليا بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، وقف عملية تجميد التجفيف عندما درجة حرارة السيلية لا تزال ثابتة. إزالة القارير وختم فورا لهم مع قبعات المسمار المقدمة.
أولا إضافة 1.5 غرام من mycelia وكرة طحن في جرة طحن من مطحنة الكرة. طحن مسحوق mycelial في 25 هرتز لمدة 30 ثانية ونقل مسحوق mycelial إلى أنبوب الطرد المركزي 15 ملليلتر. إمالة الأنبوب للسماح خلط لاحقة من المزيج مع العازلة، ثم إضافة ستة ملليلتر من الجليد الباردة استخراج العازلة B250، بما في ذلك كوكتيل مثبطات البروتياز 1X، في غرام من مسحوق mycelial ومزيج مع ملعقة صغيرة حتى يتحقق التجانس الكامل لاستخراج الخام؛ والحفاظ على أنبوب على الجليد لمدة خمس دقائق.
التالي في مكان أنبوب وأنبوب التوازن في جهاز طرد مركزي وتدور في 40، 000 مرات ز وعلى أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة على الأقل. خلال الطرد المركزي، وضعت عمود اللونية 10 ملليلتر المتاح للبدء في اكويفيرت الراتنج IgG. مايette 300 ميكرولترات من جيدا resuspended IgG الراتنج في العمود.
تعبئة العمود إلى 10 ملليلتر مع B250 والسماح للتدفق من خلال العازلة من خلال الجاذبية. إضافة ملليلتر واحد من B250 بما في ذلك 1X protease المانع كوكتيل والسماح لها من خلال التدفق، ثم سد الجزء السفلي من العمود. بعد الطرد المركزي، وإزالة 10 ميكرولترات من عظمى لتحليل SDS-PAGE.
ضع العينة في أنبوب 1.5 ملليلتر يحتوي على 40 ميكرولترتر من الماء و12.5 ميكرولترات من 5X LSB. باستخدام ماصة المصلية، وإزالة بعناية فائقة ونقلها إلى العمود الذي يحتوي على الخرز IgG اختلال. أغلق العمود بإحكام تأمين غطاء النهاية المتوفرة.
للبدء، احتضان عمود الكروماتوغرافيا على خلاط دوار في 10 دورة في الدقيقة وعند أربع درجات مئوية لمدة ساعتين إلى أربع ساعات. بعد ذلك، قم بإزالة الغطاء وافتح العمود في الأسفل لجمع التدفق من خلال. لغسل العمود، واستخدام أنبوب لإضافة ملليلتر واحد من العازلة الغسيل 250 إلى غطاء العمود لإزالة أي حبات المحاصرين ونقل هذا التعليق في تدفق واحد على الراتنج استقر لإعادة رمي الخرز.
ثم املأ العمود إلى الأعلى مع الغسيل العازل 250 وإغلاقه باستخدام غطاء مكدس متصل بمضخة م peristaltic. بدء المضخة ال peristaltic وضبط المضخة إلى معدل تدفق ما يقرب من واحد إلى خمسة ملليلتر في الدقيقة الواحدة، كرر هذه العملية الغسيل لما مجموعه أربعة يغسل، ثم كرر هذه العملية غسل ثلاث مرات باستخدام TEV العازلة التوازن. أغلق عمود الكروماتوغرافيا في الأسفل.
Resuspend الخرز IgG في ملليلتر واحد من العازلة انشقاق TEV وإضافة 20 ميكرولتر من كوكتيل مثبطات 50X protease فضلا عن 10 ميكرولترات من TEV. الغطاء التالي العمود واحتضان على خلاط دوار في 10 دورة في الدقيقة وعند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها لteute مجمعات البروتين ملزمة عبر HDAC الموسومة. في اليوم التالي، افتح العمود واجمع الـ eluate في أنبوب طرد مركزي بمليلتر.
استخدام 0.7 ملليلتر من TEV الانقسام العازلة لإزالة الخرز من الغطاء وشطف جدار العمود. ضع أنبوب الطرد المركزي الذي بـ 2 ملليلتر في أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر ثم ضع العمود على أنبوب المليلتر المفتوح. نقل هذا التجميع كله على جهاز طرد مركزي الطاولة وتدور في 300 مرات ز لمدة دقيقتين للحصول على مُمَازل TEV.
في هذه الدراسة، يتم تنفيذ إثراء خطوة واحدة من فئة 1 HDAC الموسومة TAP من الفطريات الشعيرات Aspergillus nidulans لتقييم نشاط deactylase في المختبر. والنتيجة النموذجية لهذا توضح بوضوح فعالية الخطوة الألفة الأولى، والتي تزداد حتى عند إجراء التنقية جنبا إلى جنب. معظم البروتينات البارزة الموجودة في مستخلص البروتين وتدفق من خلال، ومع ذلك، بالفعل استنفدت في الـ TEV eluate.
يظهر مناعي إشارات قوية تهاجر في حوالي 120 كيلودالتون المقابلة لBP-الموسومة كامل طول RPDA في مائل TEV, تدفق المهذلولين من خلال, وكسور مزيل. يظهر هنا مقايسة نشاط deactylase تمثيلي مع مثبط HDAC المحدد A. وتؤكد حساسية النشاط أن القيم المقاسة ترجع إلى RpdA وليست ناجمة عن نشاط غير محدد للبروتياز.
هذا مهم لأنه يشير إلى أن بروتياز TEV ، الموجود بتركيز عالٍ إلى حد ما ، لا يتعارض مع مقايسة نشاط HDAC. ومن المثير للاهتمام، يتم تخفيض نشاط HDAC بشكل كبير بعد الخطوة الثانية لتنقية التقارب، CE، بالمقارنة مع مُلَح TEV. من أجل السماح استخراج البروتين كفاءة، وضمان أن الزليّة هي الأرض إلى مسحوق ناعم.
هذا أمر بالغ الأهمية بشكل خاص عندما لا تتوفر آلة ويتم استخدام قذائف الهاون و pestle للطحن. إضافة خطوة تقارب الثاني إلى البروتوكول النتائج في كسور نقية بما فيه الكفاية لتحديد البروتين ولكن القيام به على الطيف الشامل. عند العمل مع النيتروجين السائل، تأكد من ارتداء نظارات السلامة والقفازات الواقية لتجنب الإصابة الشخصية.
