RpdA 와 같은 클래스 1 히스톤 deacetylases는 곰팡이 감염의 치료를위한 잠재적 인 새로운 대상으로 논의된다. 그러나, 정제 효소 활동은 추가 특성화를 위해 요구된다. 이 프로토콜의 주요 장점은 한 단계의 활동 측정을 위해 네이티브 TAP 태그 복합체의 신속하고 충분한 분리입니다.
이 프로토콜에서 유래된 HDAC 복합체는 새로운 곰팡이 특이적 데박틸라제 억제제의 효능 스크리닝에 사용될 수 있다. 이 방법은 TAP 태그된 곰팡이 단백질의 추출 및 정제의 기초를 제공하며, 이는 다른 효소 및 균주에 대한 프로토콜 의정서 의확립을 위한 출발점으로 사용될 수 있다. 이 절차를 시작하려면 준비된 코니디아의 각 플라스크에 10 밀리리터의 CSS를 추가합니다.
제공된 나사 캡으로 각 플라스크를 단단히 닫고 힘차게 흔들어 줍니다. 그 후, 멸균 접종 루프를 사용하여 남은 코니디아를 완전히 긁어냅니다. 원심분리기 튜브에 놓인 40마이크로미터 세포 스트레이너를 통과하고 5개의 플라스크에서 서스펜션을 하나의 튜브로 수집합니다.
그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 샘플을 결합하고 희석하기 위해 샘플을 원심분리합니다. 플라스크 위에 깔때기에 치즈천 1위. 준비된 미셀리아를 천을 걸기하고 탈이온물로 간략하게 씻습니다.
치즈천을 손 과 종이 타월 사이에 짜서 가능한 한 많은 수분을 제거하십시오. 그 후, 말린 된 균을 평평한 시트로 나사 뚜껑이있는 플라스틱 비커로 옮기. 액체 질소를 사용하여, 균소를 플래시 동결하고 lyophilization 전에 영하 80도에서 저장합니다.
그런 다음 하룻밤 동안 신비를 구사합니다. 다음 날, 미셀리아의 온도가 일정하게 유지되면 동결 건조 과정을 중지합니다. 비커를 제거하고 즉시 제공된 나사 캡으로 밀봉합니다.
먼저 1.5 그램의 미셀리아와 연삭 공을 볼 밀의 연삭 항아리에 넣습니다. 30초 동안 25 헤르츠에서 균사 분말을 갈아서 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 균등 분말을 전달합니다. 완충제와 신비의 후속 혼합을 허용하기 위해 튜브를 기울인 다음, 1X 프로테아제 억제제 칵테일을 포함하여 6 밀리리터의 얼음 냉기 추출 버퍼 B250을 추가하고, 균류 분말의 그램당 작은 주걱과 혼합하여 원유 추출물의 완전한 균질화가 달성될 때까지 작은 주걱으로 혼합하십시오.
다음으로 튜브와 밸런스 튜브를 원심분리기에 넣고 40, 000배, 섭씨 4도에서 최소 20분간 회전합니다. 원심 분리 하는 동안, IgG 수지 평형 시작 10 밀리 리터 일회용 크로 마 토 그래 피 컬 럼을 설정 합니다. 파이펫 300 마이크로리터의 잘 재중단 된 IgG 수지컬이 열에 들어갑니다.
컬럼을 B250으로 10밀리리터로 채우고 버퍼가 중력에 의해 흐르도록 합니다. 1X 프로테아제 억제제 칵테일을 포함하여 B250의 밀리리터 1밀리리터를 넣고 흐르는 다음 컬럼의 바닥을 연결합니다. 원심 분리 후 SDS-PAGE 분석을 위해 상퍼나탄의 마이크로리터 10편을 제거합니다.
샘플을 40 마이크로리터의 물과 5X LSB의 12.5 마이크로리터를 포함하는 1.5 밀리리터 튜브에 넣습니다. 세로지학적 파이펫을 사용하여 상체를 조심스럽게 제거하고 평형 IgG 구슬이 들어 있는 열로 옮긴다. 제공된 끝 한도를 단단히 고정하여 열을 닫습니다.
시작하려면 10 rpm에서 4도에서 회전 믹서에 크로마토그래피 컬럼을 2~4시간 동안 배양합니다. 이 후 캡을 제거하고 아래쪽의 열을 열어 흐름스루를 수집합니다. 컬럼을 세척하려면 파이퍼터를 사용하여 트랩된 구슬을 제거하고 이 현탁액을 정착된 수지에 하나의 플러시로 전송하여 구슬을 다시 보습하는 열 캡에 세척 버퍼(250)의 밀리리터 1밀리리터를 추가합니다.
그런 다음 열을 세척 버퍼(250)로 위로 채우고 연동 펌프에 연결된 스택 캡을 사용하여 닫습니다. 연동 펌프를 시작하고 펌프를 분당 약 1~5밀리리터의 유량으로 조정한 다음 총 4개의 세척을 위해 이 세척 공정을 반복한 다음 TEV 평형 버퍼를 사용하여 이 세척 공정을 세 번 반복합니다. 하단의 크로마토그래피 컬럼을 닫습니다.
TEV 분열 버퍼의 1 밀리리터에 IgG 구슬을 다시 중단하고 50X 프로테아제 억제제 칵테일20 마이크로리터와 TEV10 마이크로리터를 추가합니다. 다음으로 컬럼을 캡하고 10rpm에서 로터리 믹서에 배양하고 밤새 섭씨 4도에서 태그된 HDAC를 통해 결합된 단백질 복합체를 엘로우트합니다. 다음 날, 컬럼을 열고 2 밀리리터 원심분리기 튜브에서 용액을 수집합니다.
TEV 분열 버퍼0.7 밀리리터를 사용하여 캡에서 구슬을 제거하고 컬럼벽을 헹구는다. 2밀리리터 원심분리기 튜브를 50밀리리터 원심분리기 튜브에 넣은 다음 컬럼을 개방형 2밀리리터 튜브에 놓습니다. 이 전체 어셈블리를 탁상 원심분리기로 옮기고 TEV 용출을 얻기 위해 2분 동안 300배 g로 회전합니다.
이 연구에서는, 필라멘트 균류 아스퍼질러스 니둘란스의 TAP 태그 클래스 1 HDAC의 단단계 농축은 체외 deactylase 활동의 평가를 위해 수행됩니다. 이것의 전형적인 결과는 명확하게 탠덤 정화를 수행할 때 더욱 증가되는 첫번째 친화성 단계의 효험을 명확하게 보여줍니다. 단백질 추출물과 유동에 존재하는 대부분의 눈에 띄는 단백질은 TEV 용출에서 이미 고갈되어 있습니다.
면역블롯은 TEV 용출, 칼모둘린 유동 및 용출분획에서 CBP 태그가 지정된 전체 길이 RpdA에 해당하는 약 120킬로톤으로 마이그레이션하는 강력한 신호를 보여줍니다. 특정 HDAC 억제제 트리호스타틴 A를 가진 대표적인 deactylase 활성 분석법이 여기에 도시된다. 활동의 감도는 측정된 값이 RpdA 때문이며 특이하지 않은 프로테아제 활성으로 인한 것이 아님을 확인합니다.
이는 다소 고농도로 존재하는 TEV 프로테아제가 HDAC 활동 분석에 방해가 되지 않는다는 것을 나타내기 때문에 중요합니다. 흥미롭게도, HDAC 활성은 TEV 용출과 비교했을 때 제2 친화 정화 단계, CE 후 현저히 감소된다. 효율적인 단백질 추출을 허용하기 위해, 미셀리아가 미세 한 분말에 접지되어 있는지 확인하십시오.
이는 기계가 사용할 수 없고 박격포와 유봉이 연삭에 사용되는 경우에 특히 중요합니다. 프로토콜에 두 번째 친화성 단계를 추가하면 단백질 식별을 위해 충분히 순수하지만 질량 분석법에서 수행된 분수로 생성됩니다. 액체 질소로 작업 할 때, 부상을 방지하기 위해 안전 고글과 보호 장갑을 착용해야합니다.
