Deacetilasi istonolari di classe 1 come RpdA sono discusse come potenziali nuovi obiettivi per il trattamento delle infezioni fungine. Tuttavia, sono necessarie attività enzimatiche purificate per l'ulteriore caratterizzazione. Il vantaggio principale di questo protocollo è la separazione rapida e sufficiente dei complessi nativi con tag TAP per la determinazione dell'attività in un unico passaggio.
Complessi HDAC derivati da questo protocollo possono essere utilizzati per lo screening di efficacia di nuovi inibitori della deactilasi fungina specifica. Questo metodo fornisce la base per l'estrazione e la purificazione di proteine fungine taggate TAP, che potrebbero essere utilizzate come punto di partenza per la definizione di protocolli per altri enzimi e ceppi. Per iniziare questa procedura, aggiungere 10 millilitri di CSS a ogni pallone di conidia preparata.
Chiudere saldamente ogni pallone con il tappo a vite fornito e agitare vigorosamente. Dopo questo, utilizzare un ciclo di inoculazione sterile per raschiare completamente qualsiasi conidia rimanente. Passare la conidia attraverso filtri cellulari da 40 micrometri posizionati su un tubo di centrifuga e raccogliere la sospensione da cinque dei contenitori in un unico tubo.
Quindi centrifugare i campioni per combinare e diluire i campioni come delineato nel protocollo di testo. Primo posto cheesecloth in un imbuto sopra un pallone. Filtrare la micelia preparata attraverso il panno e lavare brevemente con acqua deionizzata.
Rimuovere quanta più umidità possibile dalla micelia spremendo la tela da formaggio tra le mani e poi tra gli asciugamani di carta. Dopo questo, trasferire la micelia essiccata come fogli piatti in un becher di plastica con un coperchio a vite. Usando azoto liquido, congelare flash la mielia e conservarla a meno 80 gradi Celsius prima della liofilizzazione.
Poi liofilizzare la mecelia da un giorno all'altro. Il giorno dopo, interrompere il processo di liofilizzazione quando la temperatura della micelia rimane costante. Rimuovere i becher e sigillarli immediatamente con i tappi a vite forniti.
Per prima cosa aggiungere 1,5 grammi di micelia e una palla di macinazione nel barattolo di rettifica di un mulino a sfera. Macinare la polvere miceliale a 25 hertz per 30 secondi e trasferire la polvere miceliale in un tubo di centrifuga da 15 millilitri. Inclinare il tubo per consentire la successiva miscelazione della micelia con il tampone, quindi aggiungere sei millilitri di tampone di estrazione ghiacciato B250, incluso il cocktail inibitore della proteasi 1X, per grammo di polvere miceliale e frullare con una piccola spatola fino a raggiungere la completa omogeneizzazione dell'estratto grezzo;mantenere il tubo sul ghiaccio per cinque minuti.
Quindi posizionare il tubo e un tubo di equilibrio in una centrifuga e girare a 40.000 volte g e a quattro gradi Celsius per almeno 20 minuti. Durante la centrifugazione, impostare una colonna cromatografica monouso da 10 millilitri per iniziare ad equilibrare la resina IgG. Pipetta 300 microlitri di resina IgG ben rimorsizzata nella colonna.
Riempire la colonna a 10 millilitri con B250 e lasciare che il buffer fluisca per gravità. Aggiungere un millilitro di B250 incluso il cocktail inibitore della proteasi 1X e lasciarlo scorrere, quindi collegare la parte inferiore della colonna. Dopo la centrifugazione, rimuovere 10 microlitri del supernatante per l'analisi SDS-PAGE.
Posizionare il campione in un tubo da 1,5 millilitri contenente 40 microlitri di acqua e 12,5 microlitri di 5X LSB. Utilizzando una pipetta sierologica, rimuovere con cura il supernatante e trasferirlo sulla colonna contenente le perline IgG equilibrate. Chiudere la colonna fissando saldamente il tappo finale fornito.
Per iniziare, incubare la colonna cromatografica su un miscelatore rotante a 10 giri/min e a quattro gradi Celsius per due o quattro ore. Successivamente, rimuovere il cappuccio e aprire la colonna nella parte inferiore per raccogliere il flusso. Per lavare la colonna, utilizzare un pipetter per aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio 250 al cappuccio della colonna per rimuovere eventuali perline intrappolate e trasferire questa sospensione in un unico filo sulla resina stabilizzata per rimpignare le perline.
Quindi riempire la colonna fino alla parte superiore con il tampone di lavaggio 250 e chiuderla utilizzando un tappo stack collegato a una pompa peristaltica. Avviare la pompa peristaltica e regolare la pompa a una portata di circa uno o cinque millilitri al minuto, ripetere questo processo di lavaggio per un totale di quattro lavaggi, quindi ripetere questo processo di lavaggio tre volte utilizzando il buffer di equilibrazione TEV. Chiudere la colonna cromatografica nella parte inferiore.
Rimescolare le perline IgG in un millilitro di tampone di scissione TEV e aggiungere 20 microlitri di cocktail inibitore della proteasi 50X e 10 microlitri di TEV. Quindi capovolgi la colonna e incuba su un miscelatore rotante a 10 giri/min e a quattro gradi Celsius durante la notte per elutare i complessi proteici legati attraverso l'HDAC taggato. Il giorno dopo, aprire la colonna e raccogliere l'eluato in un tubo di centrifuga a due millilitri.
Utilizzare 0,7 millilitri di tampone di scissione TEV per rimuovere le perline dal cappuccio e risciacquare la parete della colonna. Posizionare il tubo di centrifuga a due millilitri in un tubo di centrifuga da 50 millilitri, quindi posizionare la colonna sul tubo aperto a due millilitri. Trasferire l'intero gruppo su una centrifuga da tavolo e girare a 300 volte g per due minuti per ottenere l'eluito TEV.
In questo studio, viene eseguito un arricchimento in un'unica fase di un HDAC di classe 1 con tag TAP dal fungo filamentoso Aspergillus nidulans per la valutazione dell'attività della deactilasi in vitro. Un risultato tipico di questo illustra chiaramente l'efficacia del primo passo di affinità, che viene ulteriormente aumentato quando si esegue la purificazione tandem. La maggior parte delle proteine prominenti presenti nell'estratto proteico e nel flusso attraverso, tuttavia, sono già esaurite nell'eluato TEV.
Un'immunoblot mostra forti segnali che migrano a circa 120 kilodalton corrispondenti alla RpdA a lunghezza intera taggata da CBP nell'eluito TEV, nel flusso di calmodulina e nelle frazioni eluate. Qui viene mostrato un saggio rappresentativo di attività della deactilasi con l'inibitore specifico dell'HDAC Trichostatin A. La sensibilità dell'attività conferma che i valori misurati sono dovuti a RPDA e non causati da attività proteasi non specifica.
Questo è importante in quanto indica che la proteasi TEV, che è presente a una concentrazione piuttosto elevata, non interferisce con il saggio di attività HDAC. È interessante notare che l'attività dell'HDAC è significativamente ridotta dopo la seconda fase di purificazione dell'affinità, CE, rispetto all'eluiato TEV. Al fine di consentire un'efficiente estrazione delle proteine, assicurarsi che la mecelia sia macinata a polvere fine.
Ciò è particolarmente critico quando non è disponibile alcuna macchina e malta e pestello vengono utilizzati per la rettifica. L'aggiunta della seconda fase di affinità al protocollo si traduce in frazioni abbastanza pure per l'identificazione delle proteine ma fatte sulla spettrometria di massa. Quando si lavora con azoto liquido, assicurarsi di indossare occhiali di sicurezza e guanti protettivi per evitare lesioni personali.
