Класс 1 гистон deacetylases как RpdA обсуждаются в качестве потенциальных новых целей для лечения грибковых инфекций. Однако для дальнейшей характеристики необходимы очищенные ферментные действия. Основным преимуществом этого протокола является быстрое и достаточное разделение родных комплексов с тегами TAP для определения активности в один шаг.
Комплексы HDAC, полученные из этого протокола, могут быть использованы для скрининга эффективности новых грибковых ингибиторов деактилазы. Этот метод обеспечивает основу для извлечения и очистки грибковых белков с тегами TAP, которые могут быть использованы в качестве отправной точки для создания протоколов для других ферментов и штаммов. Чтобы начать эту процедуру, добавьте 10 миллилитров CSS в каждую колбу подготовленной конидии.
Плотно закройте каждую колбу предоставленной винтовой крышкой и встряхните энергично. После этого используйте стерильную петлю прививки, чтобы полностью соскребать все оставшиеся конидии. Перейдите конидию через 40-микрометровые клеточные ситечко, помещенные на центрифугу, и соберите суспензию из пяти колб в одну трубку.
Затем центрифуга образцов объединить и разбавить образцы, изложенные в текстовом протоколе. Первое место марлю в воронку на вершине колбы. Фильтр подготовленная мицелия через ткань и мыть кратко с деионизированной водой.
Удалите как можно больше влаги из мизелии, сжимая марлю между руками, а затем между бумажными полотенцами. После этого перенесите высушенную микелию в качестве плоских листов в пластиковый стакан с винтовой крышкой. Используя жидкий азот, флэш-заморозить mycelia и хранить его при температуре минус 80 градусов по Цельсию до лиофилии.
Затем лиофилизировать mycelia ночь. На следующий день прекратите процесс замораживания сушки, когда температура мизелии остается постоянной. Снимите стаканы и немедленно запечатайте их с помощью предусмотренных винтовых колпачков.
Сначала добавьте 1,5 грамма мизелии и шлифовальный шарик в шлифоваю банку шариковой мельницы. Измельчите мицелиальный порошок на 25 герц в течение 30 секунд и перенесите мицелиальный порошок в 15-миллилитровую центрифугу. Наклоните трубку, чтобы позволить последующее смешивание микелии с буфером, затем добавьте шесть миллилитров ледяного буфера экстракции B250, включая 1X ингибитор протеазы коктейль, на грамм мицелиального порошка и смешайте с небольшим шпателем до полной гомогенизации сырой экстракт достигается; держать трубку на льду в течение пяти минут.
Затем поместите трубку и балансовую трубку в центрифугу и вращайся при 40 000 раз г и при четырех градусах Цельсия в течение не менее 20 минут. Во время центрифугации, установить 10-миллилитровый одноразовый хроматографический столбец, чтобы начать равномерный IgG смолы. Пипетт 300 микролитров хорошо ресуспенной смолы IgG в колонну.
Заполните столбец до 10 миллилитров с B250 и пусть буфер протекать под действием силы тяжести. Добавьте один миллилитр B250, включая 1X ингибитор протеазы коктейль и дайте ему течь через, а затем подключить нижней части колонки. После центрифугации удалите 10 микролитров супернатанта для анализа SDS-PAGE.
Поместите образец в 1,5-миллилитровую трубку, содержащую 40 микролитров воды и 12,5 микролитров 5X LSB. Используя серологическую пипетку, аккуратно снимите супернатант и перенесите его на колонку, содержащую уравновешенные бусинки IgG. Закройте столбец, плотно закрепив предусмотренную крышку конца.
Для начала инкубировать хроматографическую колонку на роторном миксере при 10 об/мин и при четырех градусах по Цельсию в течение двух-четырех часов. После этого снимите крышку и откройте столбец внизу, чтобы собрать поток через. Чтобы вымыть столбец, используйте пипетку, чтобы добавить один миллилитр стирального буфера 250 к крышке столбца, чтобы удалить любые захваченные бусы и передать эту подвеску в одном флеше на оседлую смолу, чтобы повторно использовать бисер.
Затем заполните столбец доверху с помощью стирального буфера 250 и закройте его с помощью крышки стека, подключенной к перистальтическому насосу. Запустите перистальтический насос и отрегулируйте насос до скорости потока примерно от одного до пяти миллилитров в минуту, повторите этот процесс стирки в общей сложности четыре моет, а затем повторить этот процесс стирки три раза с помощью буфера эквилибрации TEV. Закройте колонку хроматографии внизу.
Resuspend IgG шарики в один миллилитр буфера расщепления TEV и добавить 20 микролитров 50X ингибитора протеазы коктейль, а также 10 микролитров TEV. Следующая крышка колонки и инкубировать на роторный смеситель при 10 об / мин и при четырех градусах по Цельсию в одночасье, чтобы elute белковых комплексов, связанных через помечены HDAC. На следующий день откройте колонну и соберите элуат в двухми миллилитровую центрифугу.
Используйте 0,7 миллилитров буфера расщепления TEV, чтобы удалить бисер из крышки и промыть стену колонны. Поместите двухми миллилитровую центрифугу в 50-миллилитровую центрифугу, а затем поместите колонку на открытую двухми миллилитровую трубку. Перенесите всю эту сборку на столешницу центрифугу и вращайте по 300 раз г в течение двух минут, чтобы получить TEV eluate.
В этом исследовании, одношаговое обогащение TAP-тегами класса 1 HDAC из нити гриба Aspergillus nidulans выполняется для оценки активности деактилазы в пробирке. Типичный результат этого ясно иллюстрирует эффективность первого шага сродства, который еще больше увеличивается при выполнении тандемной очистки. Большинство известных белков, присутствующих в экстракте белка и поток через, однако, уже истощены в TEV eluate.
Иммуноблот показывает сильные сигналы, мигрирующие примерно на 120 килодальтонов, соответствующих CBP-тегами полнометражный RpdA в TEV eluate, calmodulin поток через, и элуат фракций. Здесь показан репрезентативный анализ активности деактилазы с помощью специфического ингибитора HDAC Трихостатина А. Чувствительность действия подтверждает, что измеренные значения обусловлены RpdA и не вызваны неспецифической активностью протеазы.
Это важно, поскольку указывает на то, что протеаза TEV, которая присутствует при довольно высокой концентрации, не мешает анализу активности HDAC. Интересно, что активность HDAC значительно снижается после второго шага очищения сродства, CE, по сравнению с TEV eluate. Для того, чтобы обеспечить эффективную экстракции белка, убедитесь, что мизелии землю для тонкого порошка.
Это особенно важно, когда нет машины доступны и раствора и пестика используются для измельчения. Добавление второго шага сродства к протоколу приводит к фракциям, достаточно чистым для идентификации белка, но делается на масс-спектрометрии. При работе с жидким азотом, убедитесь, что носить защитные очки и защитные перчатки, чтобы избежать травм.
