يصف هذا البروتوكول الخطوات الرئيسية في توليد وتعظيم كفاءة ناقلات sgRNA. إن سعينا قبل أن نُعد المرشح SgRNA يستهدف الوقت والاستدلال النسبيين. والميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هو أنه يجعل من الممكن لتحليل الانطباعات الترميز الحمض النووي لكل من sgRNAs دون تحرير الجينات الذاتية.
ويمكن أيضا تطبيق طريقة الاختيار المسبق هذه على تدابير تحرير الجينات الأخرى من خلال فترات الراحة المزدوجة. تبدأ عن طريق تخفيف oligonucleotides مبيد البيدوغين إلى تركيز نهائي من 10 ميكرومولار في الماء المقطر مزدوجة. تخلط إلى الأمام وعكس oligonucleotides في أنبوب PCR رقيقة الجدران بنسبة واحد إلى واحد دون إضافة أي عازلة إضافية.
احتضان الخليط في 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق، ثم منحدر إلى أسفل درجة الحرارة إلى 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. إزالة مزيج oligonucleotide من آلة PCR والسماح لها لتبرد في درجة حرارة الغرفة. هضم متجه pX330-xCas9، مع Bbs1، والجمع بين الناقل والانزيم، ومخزن الهضم في حجم 50 ميكرولتر واحتضان رد الفعل في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.
بعد إجراء تحويل الخلايا، واختيار خمسة إلى 10 مستعمرات بكتيرية من لوحة LB واستخدام كل واحد منهم لتطعيم ملليلتر واحد من وسائل الإعلام LB مع 60 ملليغرام أمبيسيلين في أنبوب 1.5 ملليلتر. ثم احتضان الأنابيب على شاكر دوار لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات. قم بإجراء PCR لفحص البلازميدات المؤتلفة كما هو موضح في مخطوطة النص، ثم قم بتشغيل المنتجات على جل Agarose بنسبة 2٪تحت 10 فولت لكل سنتيمتر.
بعد تحديد البلازميدات الإيجابية ، واستخدامها ، جنبا إلى جنب مع ناقل مراسل ، للمشاركة في نقل خط الخلية المناسبة. لlyse الخلايا، وإزالة المتوسطة النمو من الخلايا المستنمَد. غسل بلطف سطح السفينة الثقافة مع برنامج تلفزيوني والاستغناء 100 ميكرولتر من PLB في كل ثقافة بشكل جيد لتغطية طبقة الخلية أحادية تماما.
اترك الطبق يحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة، ثم انقل اللساتية إلى أنبوب أو قارورة لمزيد من المناولة أو التخزين. لتنفيذ مقايسة لوسيفراز المزدوجة، قم ببرمجة المقاييس المضيئة لتوفير تأخير ما قبل القراءة الثانيين متبوعاً بفترة قياس 10 ثوانٍ. ثم، الاستغناء 100 ميكرولترات من مُسايس luciferase الكاشف في العدد المناسب من أنابيب المضيء.
إضافة بعناية 20 ميكرولترات من الخلية lysate في أنبوب مضيئة ومزيج عن طريق الأنابيب مرتين أو ثلاث مرات. ضع الأنبوب في المضيء وابدأ القراءة. إزالة أنبوب عينة من مضيئة.
إضافة 100 ميكرولترات من الكاشف وقف ودوة لفترة وجيزة لخلط. أرجع العينة إلى مقياس الإضاءة وابدأ القراءة. سجل نشاط رينيها لوسيفراز، تطبيع إلى نشاط لوسيفراز اليرا، وتحديدا تبادل النسبة المعروضة على الشاشة.
تخلص من أنبوب التفاعل عند الانتهاء. وقد استخدمت هذه الطريقة لتوليد ثلاثة ناقلات sgRNA للأغنام DKK2 إكسون 1. تم بناء ناقلات sgRNA وxCas9 المعبرة عن ذلك عن طريق هضم العمود الفقري للمتجهات متبوعة بربطها في سلسلة من شظايا الحمض النووي قصيرة مزدوجة حبلا من خلال أزواج القلة.
تم فحص سبع مستعمرات بكتيرية مع زوج التمهيدي محددة موجهة PCR واكتشفت المستعمرات الإيجابية. تم الكشف عن قدرات استهداف الجينات pX330-xCas9 T1 و T2 و T3 في وقت واحد مع مقايسة لوسيفيراز المزدوجة. وعرض آخر متجه من SgRNA أعلى إشارة الكشف واستخدم فيما بعد في أبحاث تحرير جينات الأغنام.
بعد هذا البروتوكول، يمكن إجراء فحص T7EI أو مقايسة ريبونوكلي. هذه التدابير الإضافية تعطي انطباعات أكثر دقة عن تحرير الجينات الذاتية.
