Bu protokol, verimli sgRNA vektörlerinin üretilmesi ve optimizasyonundaki önemli adımları açıklar. Aday sgRNA'nın ön ivmesi göreceli zamanı ve çıkarımları hedeflemektedir. Bu protokolün en büyük avantajı, endojen genleri düzenlemeden her bir sgRNA için DNA kodlama gösterimlerinin analiz edilebilmektedir.
Bu ön seçim yöntemi, çift iplikli molalar yoluyla diğer gen düzenleme önlemlerine de uygulanabilir. Lyophilized oligonükleotidleri çift distile suda 10 mikromolar son konsantrasyonuna seyrelterek başlayın. İnce duvarlı PCR tüpünde ileri ve ters oligonükleotidleri bire bir oranında ekstra tampon eklemeden karıştırın.
Karışımı 95 derecede 5 dakika kuluçkaya yatırın, sonra sıcaklığı 10 dakika boyunca 72 dereceye düşürün. Oligonükleotid karışımını PCR makinesinden çıkarın ve oda sıcaklığında soğumasını bekleyin. Bbs1 ile pX330-xCas9 vektörü sindirmek için vektör, enzim ve sindirim tamponunu 50 mikrolitrelik bir hacimde birleştirin ve reaksiyonu 37 derecede iki saat kuluçkaya yatırın.
Hücre dönüşümü yaptıktan sonra, LB plakabeş ila 10 bakteri kolonileri seçin ve 1.5 mililitretüp 60 miligram ampisilin ile LB medya bir mililitre aşılamak için her birini kullanın. Sonra tüpleri bir döner çalkalayıcının üzerine 2-3 saat kuluçkaya yatırın. Metin el yazmasında açıklandığı gibi rekombinant plazmidleri taramak için PCR'yi gerçekleştirin, ardından ürünleri 10 volt santimetrenin altında %2'lik Agarose jel üzerinde çalıştırın.
Pozitif plazmidleri tanımladıktan sonra, uygun bir hücre hattını eş-transfect için, bir muhabir vektörü ile birlikte kullanın. Hücreleri lyse için, kültürlü hücrelerden büyüme ortamı kaldırın. Kültür kabının yüzeyini PBS ile hafifçe yıkayın ve hücre mono tabakasını tamamen kapsayacak şekilde her kültüre 100 mikrolitre PLB dağıtın.
Plaka 20 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yada, daha sonra daha fazla işleme veya depolama için bir tüp veya şişe için lysate aktarın. Çift luciferase tayini gerçekleştirmek için, luminometreleri iki saniyeönceden okuma gecikmesi ve ardından 10 saniyelik bir ölçüm süresi sağlamak üzere programlayın. Daha sonra, 100 mikrolitre luciferase asay reaktifini uygun sayıda luminometre tüpüne dağıtın.
Luminometre tüpüne 20 mikrolitre hücre lisatını dikkatlice ekleyin ve iki veya üç kez borulandırarak karıştırın. Tüpü luminometreye yerleştirin ve okumayı başlatın. Örnek tüpü luminometreden çıkarın.
Karıştırmak için kısa bir süre stop reaktif ve girdap 100 mikrolitre ekleyin. Örneği luminometreye geri verin ve okumayı başlatın. Firefly Luciferase aktivitesine normalleştirilen Renilla Luciferase etkinliğini, özellikle ekranda görüntülenen oranın karşılıklı olarak kaydedin.
Bittiğinde reaksiyon tüpünü atın. Bu yöntem koyun DKK2 Exon 1 için üç sgRNA vektörü oluşturmak için kullanılmıştır. sgRNA ve xCas9 ifade vektörleri vektör omurgasının önceden sindirilmesi ve ardından çift iplikli DNA parçalarının annealing oligo çiftleri aracılığıyla bir dizi kısa, çift iplikli DNA parçasıile bağlanması ile oluşturulmuştür.
Yedi bakteri kolonisi spesifik primer çifti güdümlü PCR ile tarandı ve pozitif koloniler tespit edildi. pX330-xCas9 T1, T2 ve T3'ün gen hedefleme kapasiteleri aynı anda çift luciferase testi ile tespit edildi. Son sgRNA vektörü en yüksek algılama sinyalini sergiledi ve daha sonra koyun geni düzenleme araştırmalarında kullanıldı.
Bu protokolü takiben, bir T7EI tsay veya Ribonuclease test yapılabilir. Bu ek önlemler endojen genlerin düzenlenmesi daha doğru izlenimler verir.
