القراد هي hematophagous ectoparasites، ربيسيبيفالوس microplus، المعروف شعبيا باسم القراد الماشية له تأثير اقتصادي سلبي هائل على الماشية في المناطق الاستوائية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تزايد المخاوف بشأن الظروف البيئية المتدهورة والمخاوف الصحية العامة الناجمة عن الاستخدام غير المناسب لمبيدات الكاراترام الكيميائية والمقاومة المتزايدة لفئات القراد الطفيليات التقليدية، تحفز البحوث على طرق التحكم البديلة، مثل استخدام الفطريات المُنتَكة. هذه entomopathogens تصيب بنشاط مضيفي المفصليات، من خلال بشرة واستعمار أجسامهم.
قد يكون المفصلي استجابات مختلفة للعدوى الفطرية. وينقسم الجهاز المناعي المفصلي إلى استجابات فكاهية وخلوية. تتضمن الاستجابة الفكاهية عملية الهماغلواتيشن وإنتاج جزيئات مضادات الميكروبات ، في حين أن خلايا الدم تتوسط الاستجابة المناعية الخلوية.
يتم الإبلاغ عن معظم الدراسات على الاستجابة المناعية المفصلية باستخدام الحشرات في حين أن استجابات القراد تبقى أقل استكشافًا. أيضا ، التطعيم الممرض وجمع hemolymph القراد هي تقنيات سيئة على نطاق واسع اللازمة لفهم أفضل للاستجابة المناعية للمفصليات. وفقا لذلك ، هذا الفيديو تقنيات العنوان \ تستخدم لتصوير التلقيح ، وجمع hemolymph وتجهيزها.
منذ الحويصلات القراد تواجه بعض القيود، مثل انقطاع الخلايا، وانخفاض قيمة الإنمولmph الحصول على، وانخفاض تركيز الخلايا المستردة. إصابة مباشرة على تكوين الخلايا وتحليلها. بعد جمع القراد، وغسل الإناث المتقنة.
استخدام مياه الصنبور وتزج بها في 0.5٪ حل هيبوكلوريت الصوديوم لمدة ثلاث دقائق في 500 ملليلتر كوب المتلقي. بالنسبة لنظافة بشرة، تقسيم الإناث في مجموعات متجانسة مع 20 الإناث لكل من. تم إجراء ثلاثة نسخ متماثلة من كل مجموعة.
Metarhizium robertsii blastospores استخدمت في عملية التلقيح. إضافة على السائل من خمسة microliters metarhizium blastospores التعليق على سطح فيلم البارافين البلاستيك. لتسريع عملية التطعيم، يمكن إضافة فقاعات متعددة إلى سطح فيلم البارافين البلاستيكي، كل فقاعة المقابلة لخمسة ميكرولترات.
استخدم حقنة الأنسولين فائقة الوضوح من ملليمتر واحد وإبرة 0.3 ملليمتر لوضع تعليق وتطعيمها في القراد. تذكر أن تأخذ كل الهواء من الحقنة قبل استخدامه. تلقيح 5 microliters من تعليق الفطريات في أنثى القراد بين scutum وcapitulum.
قد يكون هناك حجم صغير من الهيملmph تكون موجودة على تأطير بعد شق إبرة. كن حذراً لعدم تلقيح الهواء. تلقيح الإناث مع تعليق الفطريات بين الفخذ الساق وجسد الأنثى باستخدام حقنة الأنسولين فائقة الغرامة من ملليلتر إلى جانب إبرة 0.3 ملليمتر.
عندما يتم إجراء التطعيم بين الفخذ الساق والجسم الأنثوي، يمكن أن يكون هناك حجم صغير من الهيموليم على الفخذ بعد إدخال الإبرة. كن حذراً لعدم تلقيح الهواء. استخدام جزء من المطاط ضخ مجنحة تعيين أنبوب الشعيرات الدموية 0.3 miliimeters وطرف مرشح لأداء جمع الهيمليmph.
تعطيل بشرة الظهر الأنثوية باستخدام إبرة 0.3 ملليمتر. بعد انقطاع ممارسة ضغط لطيف على الجزء الterial من الجسم القراد. مراقبة تجمع السائل شفافة تقريبا للخروج من موقع تعطيل.
جمع الهيمولى عن طريق مص السائل من خلال طرف مرشح إلى جانب جزء من المطاط من مجموعة ضخ مجنحة وأنبوب شعري 0.3 ملليمتر. لا تضغط على جسم القراد بالكاد أثناء شل حركتها لأن هذا قد يعطل منتصف الgut ويلوث الهيملmph. الانتظار حتى الضغط لطيف يمكن طرد السائل دون تلوث.
قم بشل حركة القراد. قطع قطعة من الساق الأمامية. يمكن قطع ساق واحدة أو أكثر وكذلك يمكن قطع نفس الساق أكثر من مرة واحدة.
تطبيق ضغط لطيف على الجزء الخلفي من الجسم القراد. مراقبة فقاعة سائلة شفافة تظهر على الجانب قطع وجمعه مع أنبوب الشعرية. لا تضغط على جسم القراد بالكاد ، أثناء التعبئة لأن هذا قد يعطل منتصف المنتصف ويلوث الهيملmph.
الانتظار حتى الضغط لطيف يمكن طرد السائل دون تلوث. بعد جمع الهيمولmph، إيداعه في 1.5 mililiters microtube شغلها سابقا مع 30 كوكتيل بروتياز microlitres و 82 microlitres العازلة المالحة. الحفاظ على الأنابيب الدقيقة على الجليد في جميع أنحاء جمع الهيموالي ام.
وسيتم تشكيل عينات من أجهزة الطرد المركزي والكريات الناعمة من الهيموسيات بعد الطرد المركزي للهيمولوم. لتحديد كمية الهيمولmph، كمي حجم الهيمولmph التي تم الحصول عليها من خلال عد الحجم الإجمالي داخل microtube وخصم حجم كوكتيل البروتياز والمخزن الاحتياطي الملحي. إزالة بعناية الهيموليتف خالية من الخلايا فائقة، وبلطف إعادة تعليق الخلايا.
كمّيّة الهيموسيات بوضع 10 ميكرولترات من الهيموسيات التي تم تعليقها من قبل إعادة تعليق في غرفة نيوباور. للخلايا إعادة تعليق تم استخدام وسائط الثقافة. قطع الساق الأمامية للقراد، وتطبيق ضغط لطيف على الجزء الخلفي من الجسم القراد، ومراقبة فقاعة سائلة شفافة تظهر على موقع قطع.
تطبيق قطرات الهيملmph مباشرة على شرائح المجهر نظيفة. بعد ذلك استخدام الطرق المناسبة لطخة الخلايا. التلقيح بين الفخذ الساق والجسم الأنثوي القراد يمكن أيضا أن تلحق الضرر أعضاء داخلية القراد مثل midgut وslepighian الأنابيب.
عندما يتم تعطيل منتصف ة القراد من قبل الإبرة في جمع الأنف الظهر السائل الذي تم الحصول عليه هو أحمر، وليس شفافا. وهذا يشير إلى مجموعة هيموليmph غير صحيحة. في هذه الحالة، يتم التخلص من الهيملmph كما هو ملوث.
ويمكن أيضا أن يلاحظ التلوث بالهيمولmph عندما يتم إصابة القراد بشكل طبيعي مع كميات عالية من مسببات الأمراض، أو في الخطوات النهائية بعد عملية الموت الناجمة عن مسببات الأمراض تلقيح. حجم الهيموليم الذي تم الحصول عليه بعد جمع الظهر أعلى من الحجم الذي تم الحصول عليه في المجموعة من خلال الساق. على الرغم من سهولة التلوث هو أعلى في طريقة جمع الأولى.
وكان تركيز الهيموسيات أيضا أعلى بكثير في جمع الظهرية. عندما يتم تنفيذ الصحيح جمع خلايا الدم يمكن الحصول على مسحة جيدة وأنه من الممكن للتمييز بين أنواع مختلفة من الهيموسيات بعد تلطيخ. قدم هذا الفيديو معلومات عن طرق إجراء تلقيح مسببات الأمراض ، وعلى وجه التحديد الفطريات ذات النتوموبات ، في القراد وجمع هدم الدم.
تتطلب التقنيات المقدمة هنا موارد تكنولوجية منخفضة جدًا في خطواتنا الكلاسيكية للدراسات حول علم وظائف الأعضاء القراد ، وعلم أمراض القراد ، والاستجابة المناعية للقراد. والحصاد الصحيح للخلايا المفصلية، والهيمولى الخالي من الخلايا أمر بالغ الأهمية لتوفير معلومات موثوقة للدراسات اللاحقة. لهذا السبب، من المهم أيضا أن تكون على بينة من الأخطاء الأكثر شيوعا لوحظ في تنفيذ هذه التقنيات.
وبالإضافة إلى ذلك، تحدد مقترحات هذه الدراسة الموقع الأنسب لجمع الهيموّل المشطور من خلال تشويه الساقين أو قطعها، مع مراعاة الاختلاف في الحجم الذي تم الحصول عليه واحتمال حدوث تلوث.
