متعدد الفلورسنت مناعية يحدد أنواع الخلايا المتعددة ومواقعها في الأنسجة غير الرسمية الثابتة البارافين المضمنة، والسماح ليس فقط لتحديد الخلية ولكن أيضا الخلية إلى الخلية التحليل المكاني. والميزة الرئيسية لهذه التقنية اليدوية هي استخدام أجسام مضادة متعددة من نفس النوع دون التفاعل عبر. هذه التقنية تسمح لنظرة متعمقة في تفاعلات الخلايا المناعية والسرطانية في البيئة الدقيقة الورم.
عند تجربة هذه التقنية لأول مرة ، تسمح لمدة ثلاثة إلى أربعة أيام تقريبًا من التلطيخ وتتبع كل خطوة تمامًا أثناء العملية. إنّ الوسيلة الأضعف لعملية التلطيخ وتصميم المُتعدد أمر بالغ الأهمية لتقليل المزالق الشائعة والمتوقعة. ابدأ بإلغاء تهيئة الشرائح وإعادة تنشيطها.
وضعها في فرن التهجين مع جانب الأنسجة حتى وخبز لهم في 60 درجة مئوية لمدة ساعة. أخرجي الشرائح من الفرن واسمحي لهما بأن يبردا لمدة خمس إلى عشر دقائق في رف شريحة رأسي. ثم استخدم مجموعة تلوين الشرائح لعلاج الشرائح ثلاث مرات مع الزيلين ومرة واحدة مع الإيثانول 100٪، 95٪ الإيثانول، والإيثانول 70٪ لمدة 10 دقائق لكل من.
اغسل رف الشرائح بالماء الأيونيد ثم قم بإصلاح الشرائح عن طريق غمرها في شكلية عازلة محايدة لمدة 30 دقيقة. اغسل الشرائح بالماء لمدة دقيقتين وامضي في استرجاع المستضد. ضع رف الشرائح في صندوق مقاوم للحرارة مملوء بـ 6.0 أو درجة حِس 9.0 من مخزن استرجاع المستضد.
تغطية مربع مع التفاف من البلاستيك وتأمينه مع شريط مطاطي. ضع الصندوق في ميكروويف مجهز بالعاكس على حافة اللوحة الدوارة واسخني الشرائح لمدة 45 ثانية بقوة 100٪ متبوعة بـ 15 دقيقة بقوة 20٪. اترك الشرائح تبرد لمدة 15 إلى 20 دقيقة بعد الميكرويفينغ.
وفي الوقت نفسه، إعداد حلول العمل من الأجسام المضادة والفلوروفوريس. إعداد الجسم المضاد الرئيسي diluent عن طريق حل 0.5 غرام من حبيبات الألبومات المصل البقري في 50 ملليلتر من TBST أو 1X PBS. تخفيف كل الأجسام المضادة الأولية حل العمل إلى التركيز الأمثل المحدد سابقا.
تخفيف كل فلوريوفور في الفلوروفور diluent بتركيز من واحد إلى 100. في اليوم الأخير من تلطيخ، إعداد حل العمل DAPI بإضافة ثلاث قطرات من DAPI إلى ملليلتر واحد من TBST. بمجرد تبريد الشرائح، إزالتها من الميكروويف وخلع التفاف البلاستيك.
اغسلها بالماء غير المتأين لمدة دقيقتين تليها غسيل لمدة دقيقتين مع TBST. بعد الغسيل، جفف الانزلاق حول الأنسجة مع مسح مهمة حساسة وتتبع حول الجزء الخارجي من الأنسجة مع قلم حاجز محمّد، مع الحرص على عدم لمس الأنسجة أو السماح لها بالجفاف. ضع كل شريحة في غرفة مرطب وإضافة ما يقرب من أربع قطرات من محلول الحجب إلى الأنسجة.
ثم احتضان الشرائح لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة والمضي قدما مع تطبيق الأجسام المضادة الأولية. قم بإزالة حل الحظر من كل شريحة عن طريق النقر على جانب الشريحة على كومة من المناشف الورقية واستخدام مسح مهمة دقيقة لإزالة الحل المتبقي. ضع الشريحة مرة أخرى في غرفة الرطوبة، وأضف ما يقرب من 200 ميكرولترات من الأجسام المضادة الأولية العاملة، وحضن لمدة ساعة.
بعد الحضانة، وغسل الشرائح ثلاث مرات عن طريق غمر لهم في TBST لمدة دقيقتين لكل غسل. الداب قبالة TBST المتبقية من كل شريحة وتطبيق ما يقرب من ثلاث إلى أربع قطرات من الأجسام المضادة الثانوية. احتضان الشرائح في غرفة مرطب لمدة 10 دقائق.
غسل الشرائح مرة أخرى مع TBST وتطبيق ما يقرب من 100 ميكرولترات من حل عمل fluorophore. ارجع الشرائح إلى الغرفة المرطبة وحضن لمدة 10 دقائق. كرر غسل TBST ثم الميكروويف الشرائح وفقا لتوجيهات المخطوطة لإزالة الأجسام المضادة.
شيء مهم أن نتذكر خلال هذه العملية تلطيخ عدة أيام هو وقف بعد خطوة microwaving وترك الشرائح في العازلة استرجاع المستضد بين عشية وضحاها، وضمان سلامة الأنسجة وصمة عار. إزالة تطبيق الأجسام المضادة الماضي مع حل استرجاع مستضد وغسل الشرائح مع المياه ديونسيد تليها TBST لمدة دقيقتين لكل غسل. كرر الخطوات تلطيخ لبقية أزواج flurophore الأجسام المضادة ثم قم بالمتابعة مع تطبيق DAPI.
تطبيق ما يقرب من 150 ميكرولترات من العمل DAPI حل لكل شريحة واحتضان لهم في غرفة مرطب لمدة 10 دقيقة. بعد الحضانة، قم بغسل الشرائح باستخدام TBST لمدة 30 ثانية تقريبًا، ثم قم بتركيب زلات الغطاء. بمجرد أن تجف الوسائط المتصاعدة، قم بتطبيق تلميع الأظافر الواضح في الزوايا الأربعة لزلة الغطاء لتأمينه.
لتحليل أحادية، قم بـ صورة الشرائح على المجهر مع التعرض 250 ميلي ثانية باستخدام DAPI للتركيز. تقييم كل شريحة أحادية من خلال النظر في شدة الفلوريسنس من علامة الملون وقارن هذه الكثافة مع الخلفية. استخدم موضع الشريحة في المضاعف النهائي إذا كانت شدة العلامة الملطخة أعلى بخمس مرات على الأقل من الخلفية.
عند تلطيخ متعدد، واختيار النظام المناسب لكل الأجسام المضادة وتعيين كل fluorophore إلى جسم مضاد. المضي قدما في تلطيخ multix كما سبق وصفه وإعداد شريحة فارغة التي تتلقى صبغة الأجسام المضادة ، الفلوروفور diluent ، وTBST بدلا من الأجسام المضادة الأولية ، fluorophore ، أو DAPI. عندما تكون جاهزة لتصوير متعددة على المجهر، تعيين التعرض إلى 250 مللي ثانية لجميع القنوات والتقاط كل صورة باستخدام DAPI للتركيز.
ثم استخدام برنامج التحليل لتقييم كل مضاعف من قبل لون الفلورسنت كاذبة وبنظرة علم الأمراض، والتي سوف تؤكد خصوصية كل علامة. لضمان نجاح مقايسة تعددي، يجب إجراء مقايسة أحادية الضداد لتحديد ترتيب كل جسم مضاد. على سبيل المثال، عندما Foxp3 هو في الموضع الثالث من الصفيف، يتم إظهار تلطيخ محددة وقوية وcolccalization مع CD3.
في المقابل ، عندما Foxp3 هو في الموقف الأول ، غير محدد من Foxp3 يحدث. مناطق محببة و effuse من الأحمر موجودة على معظم الشريحة، وكثافة الفلورسنت من هذه المناطق منخفضة. خطوة أخرى هامة في هذا الفحص هي مكافحة DEPI ، والتي هي الأساس لتحديد الخلية ومزيد من التحليل.
يمكن رؤية تباين واضح بين الصور ذات DAPI العاملة وغير العاملة. بالنسبة للملايس المتعدد ، لا تعكس الصور المركبة الجميلة دائمًا وصمة عار دقيقة. في حين يتم تصور CD3 ويظهر تلطيخ محددة ، فإن منظر الحقول الساطعة في علم الأمراض من CD163 يثبت أن الجسم المضاد غير محدد.
صورة متعددة الأمثل يوضح تلطيخ محددة في صورة مركبة، ويتم تأكيد خصوصية CD3 وD163 مع عرض برايتفيلد الباثفيلد. بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء حسابات التحليل الظاهري الذاتي والتحليل المكاني لمزيد من تحليل تفاعلات الخلايا إلى الخلية. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين لاستكشاف النقش المكاني للخلايا والأنسجة السليمة ، مما يعزز فهمنا للورم microenvironment المناعة.
