אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית מולטיפלקס מזהה סוגי תאים מרובים ואת מיקומם ברקמה מוטבעת פרפין קבועה פורמלין שלם, המאפשר לא רק לזיהוי תאים אלא גם ניתוח מרחבי תא לתא. היתרון העיקרי של טכניקה ידנית זו הוא השימוש בנוגדנים מרובים מאותו המין ללא תגובתיות צולבת. טכניקה זו מאפשרת מבט מעמיק לתוך האינטראקציות של תאים חיסוניים וסרטניים microenvironment הגידול.
כאשר מנסים טכניקה זו בפעם הראשונה, לאפשר כשלושה עד ארבעה ימים של כתמים ולעקוב אחר כל צעד לחלוטין במהלך התהליך. שיטה חלשה יותר של תהליך הכתמים ועיצוב מולטיפלקס היא קריטית כדי להקטין את החסרונות הנפוצים והצפויים. התחל על ידי deparaffinizing והתייבשות מחדש של השקופיות.
מניחים אותם בתנור ההכלאה עם צד הרקמה למעלה ואופים אותם ב 60 מעלות צלזיוס במשך שעה. מוציאים את השקופיות מהתנור ומאפשרים להן להתקרר במשך חמש עד עשר דקות בארון תקשורת אנכי. לאחר מכן השתמש ערכת כתמי שקופיות לטיפול בשקופיות שלוש פעמים עם קסילן ופעם אחת עם 100%אתנול, 95%אתנול, ו 70%אתנול במשך 10 דקות כל אחד.
לשטוף את ארון התקשורת של שקופיות עם מים deionized ולאחר מכן לתקן את השקופיות על ידי שקוע אותם פורמלין במאגר ניטרלי במשך 30 דקות. לשטוף את המגלשות עם מים במשך שתי דקות ולהמשיך עם אחזור אנטיגן. מקם את ארון התקשורת של שקופיות לתוך תיבה עמידה בחום מלא pH 6.0 או pH 9.0 מאגר אחזור אנטיגן.
מכסים את הקופסה בניילון נצמד ומאבטחים אותה באמצעות גומייה. הנח את התיבה במיקרוגל המאובזר במהפך בקצה הלוח המסתובב וחמם את השקופיות למשך 45 שניות בה הספק של 100% ואחריו 15 דקות בה הספק של 20%. תן את השקופיות להתקרר במשך 15 עד 20 דקות לאחר microwaving.
בינתיים, להכין פתרונות עבודה של נוגדנים פלואורופורים. הכן את הנוגדן הראשי diluent על ידי המסת 0.5 גרם של גרגירי אלבומן בסרום בקר ב 50 מיליליטר של TBST או 1X PBS. לדלל כל פתרון עבודה נוגדן ראשוני לריכוז אופטימיזציה שנקבע בעבר.
מדללים כל פלואורופור בדילול הפלואורופור בריכוז של 1 עד 100. ביום האחרון של הכתם, הכן את פתרון העבודה DAPI על-ידי הוספת שלוש טיפות DAPI למיליליטר אחד של TBST. לאחר השקופיות מקורר, להסיר אותם מן המיקרוגל ולהוריד את ניילון נצמד.
לשטוף אותם עם מים deionized במשך שתי דקות ואחריו לשטוף שתי דקות עם TBST. לאחר הכביסה, לייבש את השקופית סביב הרקמה עם לנגב משימה עדינה ולעקוב אחר סביב החלק החיצוני של הרקמה עם עט מחסום הידרופובי, דואג לא לגעת ברקמה או לתת לו להתייבש. מניחים כל שקופית בתא מכשיר האדים ומוסיפים כארבע טיפות של פתרון חסימה לרקמה.
לאחר מכן הדגירה את המגלשות במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולהמשיך עם יישום נוגדנים ראשוני. הסר את פתרון החסימה מכל שקופית על-ידי הקשה על צד השקופית בערימת מגבות נייר ולהשתמש בניגוב משימה עדין כדי להסיר את הפתרון הנותר. מניחים את השקופית בחזרה בתא הלח, מוסיפים כ-200 מיקרוליטרים של הנוגדן הראשי העובד, ומדגירים במשך שעה.
לאחר הדגירה, לשטוף את השקופיות שלוש פעמים על ידי שקוע אותם TBST במשך שתי דקות לכל לשטוף. טבול את TBST הנותרים מכל שקופית ולהחיל כשלוש עד ארבע טיפות של נוגדן משני. הדגירה את השקופיות בתא לח במשך 10 דקות.
לשטוף את השקופיות שוב עם TBST ולהחיל כ 100 microliters של פתרון העבודה פלואורופור. מחזירים את השקופיות לתא הלח ודגירה למשך 10 דקות. חזור על לשטוף את TBST ולאחר מכן לחמם במיקרוגל את המגלשות על פי הוראות כתב היד כדי להסיר את הנוגדנים.
דבר חשוב לזכור במהלך תהליך הכתמים מרובה הימים הזה הוא לעצור לאחר שלב microwaving ולהשאיר את השקופיות במאגר אחזור אנטיגן לילה, הבטחת שלמות רקמות וכתמים. הסר את יישום הנוגדנים האחרון עם פתרון אחזור אנטיגן ולשטוף את המגלשות עם מים deionized ואחריו TBST במשך שתי דקות לכל לשטוף. חזור על שלבי הכתמים עבור שאר זוגות פלוארופור הנוגדנים ולאחר מכן המשך עם יישום DAPI.
החל כ 150 microliters של פתרון DAPI עובד על כל שקופית להדגיר אותם בתא לח במשך 10 דקות. לאחר הדגירה, לשטוף את השקופיות עם TBST במשך כ 30 שניות לטעון את החלקות המכסה. לאחר שמדיה הרכבה התייבש, להחיל לק ציפורניים ברור בארבע הפינות של להחליק את הכיסוי כדי לאבטח אותו.
כדי לנתח את המונופלקס, תדמיין את השקופיות במיקרוסקופ עם חשיפה של 250 אלפיות שניה באמצעות DAPI כדי להתמקד. להעריך כל שקופית monoplex על ידי התבוננות בעוצמת הפלואורסצנטיות של הסמן המוכתם ולהשוות עוצמה זו עם הרקע. השתמש במיקום השקופית בהולטיפלקס הסופי אם עוצמת הסמן המוכתם גבוהה לפחות פי חמישה מהרקע.
בעת הכתמת מולטיפלקס, לבחור את הסדר המתאים עבור כל נוגדן ולהקצות כל פלואורופור לנוגדן. המשך עם הכתמת מולטיפלקס כפי שתואר בעבר ולהכין שקופית ריקה שמקבלת דילואנט נוגדנים, דלורנט פלואורופור, ו TBST במקום נוגדן ראשוני, פלואורופור, או DAPI. כאשר אתה מוכן לצלם את מולטיפלקס במיקרוסקופ, הגדר את החשיפה ל- 250 אלפיות שניה עבור כל הערוצים וללכוד כל תמונה באמצעות DAPI כדי להתמקד.
לאחר מכן השתמש בתוכנת הניתוח כדי להעריך כל מולטיפלקס לפי צבע כוזב פלואורסצנטי ועל ידי תצוגת פתולוגיה, אשר יאשר את הספציפיות של כל סמן. כדי להבטיח הצלחה של בדיקת מולטיפלקס, יש לבצע בדיקת מונופלקס כדי לקבוע את הסדר של כל נוגדן. לדוגמה, כאשר Foxp3 נמצא במיקום השלישי של המערך, כתמים וקולוקליזציה ספציפיים וחזקים עם CD3 מוכחים.
לעומת זאת, כאשר Foxp3 נמצא בעמדה הראשונה, כתמים לא ספציפיים של Foxp3 מתרחשת. ברוב המגלשה קיימים אזורים מגורעים ואדומים, ועוצמת הפלואורסצנטיות של אזורים אלה נמוכה. צעד חשוב נוסף בבדיקה זו הוא הגנה נגדית DEPI, שהיא הבסיס לזיהוי תאים וניתוח נוסף.
ניתן לראות ניגודיות ברורה בין תמונות עם DAPI עובד ו- DAPI שאינו עובד. לצורך ההקפדת מולטיפלקס, תמונות מורכבות ויפות לא תמיד משקפות כתם מדויק. בעוד CD3 הוא חזותי ומראה כתמים ספציפיים, תצוגת שדה בהיר פתולוגיה של CD163 מוכיח כי הנוגדן אינו ספציפי.
תמונת מולטיפלקס אופטימלית מדגימה כתמים ספציפיים בתמונה ללא הפרדות צבע, והספות של CD3 ו- CD163 מאושרת עם תצוגת השדה הבהיר של הפתולוגיה. בעקבות הליך זה, חישובי פנוטיפים עצמיים וניתוח מרחבי יכולים להתבצע כדי לנתח עוד יותר אינטראקציות בין תאים לתאים. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים לחקור דפוסים מרחביים של תאים ורקמות שלמות, מה שמקדם את הבנתנו את המיקרו-וירוס החיסוני של הגידול.
