يوفر هذا البروتوكول طريقة لتقييم مشاركة عامل معين في الإخصاب المزدوج لعربيدوبسيس. يمكن الحكم على حالة الإخصاب من خلال مورفولوجيا نوى الحيوانات المنوية في لمحة ، وبالتالي فإن الحصول السريع على البيانات للتحليل الإحصائي ممكن. هذه الطريقة محددة لتقييم نوع الظاهري التسميد في arabidopsis.
لا يزال هناك منظمون غير معروفين للتخصيب، حتى لو كان في Arabidopsis. وهذه الطريقة ستكون مفيدة في التحليل الوظيفي لعوامل الإخصاب غير المعروفة في المستقبل. لإتقان مهارة التعامل السريع وسليمة من البويضات مهمة لنجاح هذا التحليل.
للبدء، تنمو Arabidopsis thaliana في 22 درجة مئوية تحت ضوء 16 ساعة ودورة مظلمة لمدة ثماني ساعات في غرفة النمو. قطع وإزالة أول ساق زهرة المتقدمة مع مقص لتعزيز تطوير براعم الإبط. بعد أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع من قطع الساق الأولى، وقياس ارتفاع النبات.
النباتات التي يزيد ارتفاعها عن 25 سم تعتبر النباتات التي تنمو بقوة ومناسبة للتحليل. إلى emasculate، ابحث عن براعم في المرحلة 11 مع بتات ينظر في الجزء العلوي. استخدام عدد خمسة ملقط لإزالة سيبال، بتلة، وs stamen من براعم الزهور.
15 إلى 18 ساعة بعد emasculation، واتخاذ stamen من خط DMP9-الضربة القاضية مع خلفية زهرة HTR10-mRFP في المرحلة 13 عن طريق قرص خيوط مع ملقط. لتلقيح، بات بلطف وصمة العار من pistil emasculated عدة مرات مع هدّار. بعد سبع إلى ثماني ساعات من التلقيح، وجمع pistil وضعه على الشريط على الوجهين.
ثم، اضغط بلطف مع ملقط لإصلاح pistil على الشريط. تحت مجهر تشريح، وقطع الطرفين العلوي والسفلى من المبيض باستخدام إبرة الحقن. حرك طرف إبرة الحقن لشق جدار المبيض على جانبي الـ replum.
قطع بعناية حتى لا يفصل بين funiculus والجهاز إرسال. إيفرت جدار المبيض. قرصة قاعدة الحاجز الذي ترتبط البويضات، ورفعه بعناية مع ملقط.
نقل البويضات إلى قطرة ماء على الزجاج الشريحة، وتغطي بلطف مع غطاء للمراقبة تحت المجهر الفلوري. على مجهر epifluorescence مجهزة مكعب مرشح الفلوريسين، ضبط عدسة الهدف إلى 20x أو 40x. الحصول على صور من البويضات التي تحتوي على نواة الحيوانات المنوية المسمى مع mRFP.
تأكيد عدد من نوى الحيوانات المنوية التي تحمل علامة mRFP في كيس الجنين. تأكد من شكل وموضع كل نواة الحيوانات المنوية التي تحمل علامة mRFP في كيس الجنين. في هذه الدراسة، تم الحكم على الأنماط الظاهرية للتخصيب من قبل مورفولوجيا الإشارة النووية في البويضات.
تحتوي معظم البويضات على نويات الحيوانات المنوية المسماة بـ mRFP في جانب خلية البويضة الدقيقة والجانب النهائي للخلية المركزية. وهذا يشير إلى نجاح الإخصاب المزدوج. بالإضافة إلى ذلك ، لوحظ بويضات تحتوي على نواة الحيوانات المنوية التي تحمل اسم mRFP في نواة الخلية المركزية بالإضافة إلى نواة الحيوانات المنوية المكثفة المسماة mRFP خارج خلية البويضة ، مما يشير إلى تخصيب واحد.
في حالة الإخصاب المزدوج الفاشل، لوحظ وجود نويتين من الحيوانات المنوية المكثفة المسماة mRFP عند حدود خلية البويضة والخلية المركزية. في التحليل باستخدام خط DMP9-knockdown مع خلفية من حبوب اللقاح HTR10-mRFP، نادرا ما لوحظت البويضات التي تحتوي على نواة الحيوانات المنوية مكثفة mRFP أو ثلاثة أو أكثر من نواة الحيوانات المنوية المسماة mRFP. الجمع مع استخدام خطوط علامة الإناث، ويمكن تحليل حالة الإخصاب أكثر دقة.
على سبيل المثال، يمكن الحكم على حالة الإخصاب بعد الانصهار في بعد الانصهار و قبل karyogamy. نعم، عملية الإخصاب مقسمة إلى عدة خطوات. الأسئلة التي تشارك فيها كل منظم التسميد والتي يمكن الإجابة على الخطوات مع هذه الطريقة المحسنة.
ومن شأنه أن يوفر نظرة أعمق في التكاثر الجنسي للنبات.
