Этот протокол дает возможность оценить причастность определенного фактора к двойному оплодотворению арабидопсиса. О состоянии оплодотворения можно судить по морфологии ядер спермы с первого взгляда, поэтому быстрое получение данных для статистического анализа возможно. Этот метод специфичен для оценки фенотипа оплодотворения в арабидопсисе.
Есть еще неизвестные регуляторы оплодотворения, даже если в Arabidopsis. Этот метод был бы полезен для функционального анализа будущих неизвестных факторов оплодотворения. Для успеха этого анализа важно овладеть навыками быстрой и нетронутой обработки овул.
Для начала выращивайте арабидопсис талиану при 22 градусах Цельсия при 16-часовом свете и восьмичасовом темном цикле в камере роста. Вырезать и удалить первый разработанный цветок стебель с ножницами для содействия развитию подмыслие почки. Через две-три недели после отсеив первый стебель, измерьте высоту растения.
Растения высотой свыше 25 сантиметров считаются активно растущими растениями и пригодны для анализа. Чтобы выхолощенный, ищите почки на стадии 11 с кусочками лепестков видели в верхней части. Используйте пять типсов, чтобы удалить сепар, лепестки и стамен цветочных почек.
Через 15-18 часов после выхолощения возьмите стамен линии DMP9-knockdown на фоне цветка HTR10-mRFP на стадии 13, ущипнув нить щипцом. Чтобы опылять, осторожно погладить клеймо выхолощенный pistil несколько раз с dehiscent пыль. Через семь-восемь часов после опыления соберите пестил и поместите его на двустороннюю ленту.
Затем осторожно нажмите типсами, чтобы зафиксировать pistil на ленте. Под расчленяющий микроскоп, отрезать верхний и нижний концы яичника с помощью иглы инъекции. Перемести кончик иглы для перерезания стенки яичников по обе стороны от реблума.
Вырезать тщательно, чтобы не отделить funiculus и передачи тракта. Эверт яичников стены. Ущипните основание перегородки, к которой соединены овулы, и аккуратно поднимите ее щипцы.
Перенесите овулы в каплю воды на слайд-стакан и аккуратно накройте стеклом для наблюдения под флуоресцентный микроскоп. На эпифлюоресцентном микроскопе, оснащенном кубом фильтра флуоресценции, отрегулируйте объектив до 20x или 40x. Приобретайте изображения овул, содержащих ядра спермы, помеченные mRFP.
Подтвердите количество ядер спермы с маркировкой mRFP в зародыше мешка. Подтвердите форму и положение каждого ядра спермы с маркировкой mRFP в мешке эмбриона. В этом исследовании фенотипы оплодотворения были судимы по морфологии ядерного сигнала спермы в яйцеклетке.
Большинство яйцеклеток содержали два деконденсированного ядра спермы с маркировкой mRFP на стороне микропилара яйцеклетки и центральную сторону конца клетки charazal. Это означает успешное двойное оплодотворение. Кроме того, были обнаружены яйцеклетки, содержащие ядро спермы с маркировкой mRFP в центральном ядре клетки плюс сжатое ядро спермы с маркировкой mRFP за пределами яйцеклетки, что указывает на одно оплодотворение.
В случае неудачного двойного оплодотворения на границе яйцеклетки и центральной клетки наблюдались два ядра спермы с сжатой меткой mRFP. При анализе с использованием линии DMP9-knockdown с фоном пыльцы HTR10-mRFP, яйцеклетки, содержащие одно сжатое ядро спермы с маркировкой mRFP или три или более ядер спермы с маркировкой mRFP, редко наблюдались. В сочетании с использованием женских маркерных линий можно проанализировать более точный статус оплодотворения.
Например, можно судить о статусе оплодотворения после слияния гогета и до кариогамии. Да, процесс оплодотворения делится на несколько этапов. Вопросы, которые каждый регулятор оплодотворения участвует в которых шаги могут быть даны ответы с помощью этого улучшенного метода.
Это даст более глубокое представление о сексуальном воспроизводстве растения.
