이 프로토콜은 애기독증의 이중 수정에 특정 요인의 참여를 평가하는 방법을 제공합니다. 수정 상태는 정자 핵의 형태에 의해 한눈에 판단될 수 있으므로 통계 분석을 위한 데이터의 빠른 획득이 가능합니다. 이 방법은 애기독증의 수정 표현형에 대한 평가에 특이적이다.
애기독증에도 아직 알려지지 않은 수정 규제 기관이 있습니다. 이 방법은 미래의 알려지지 않은 수정 요인의 기능 분석에 유용할 것입니다. 배란의 빠르고 온전한 취급 기술을 마스터하는 것은이 분석의 성공을 위해 중요하다.
시작하려면, 성장 챔버에서 16 시간 빛과 8 시간 어두운 주기에서 22 섭씨에서 아라비도시스 탈리아나 성장. 가위로 최초로 개발된 꽃줄기를 잘라내어 제거하여 축조류싹의 개발을 촉진합니다. 첫 번째 줄기를 끊은 후 2 ~ 3 주, 식물 높이를 측정합니다.
높이가 25cm 이상인 식물은 활발하게 성장하는 식물로 간주되며 분석에 적합합니다. 11단계에서 꽃잎조각이 맨 위에 보이는 새싹을 찾아보세요. 꽃 봉오리의 세팔, 꽃잎 및 stamen을 제거하기 위해 숫자 다섯 집게를 사용합니다.
방출 후 15~18시간 후에는 13단계에서 HTR10 mRFP 꽃의 배경이 있는 DMP9-넉다운 라인의 선석면을 집게하여 필라멘트를 집게합니다. 수분을 공급하려면, 부드럽게 dehiscent anther와 함께 여러 번 압증 된 pistil의 오명을 두드려. 수분 후 7~8시간 후에 피스틸을 모아 양면 테이프에 놓습니다.
그런 다음 집게로 부드럽게 눌러 테이프의 피스틸을 수정합니다. 해부 현미경에서, 주사 바늘을 사용하여 난소의 상부 및 하부 끝을 잘라. 주사 바늘의 끝을 이동하여 회개 의 양쪽을 따라 난소 벽을 슬릿합니다.
푸니큘러스와 송신소를 분리하지 않도록 신중하게 잘라냅니다. 난소 벽에 에버트. 난간이 연결된 중격의 베이스를 꼬집어 서 포셉으로 조심스럽게 들어 올립니다.
용란을 슬라이드 유리에 물 한 방울로 옮기고 형광 현미경으로 관찰할 수 있는 커버글래스로 부드럽게 덮습니다. 형광 필터 큐브가 장착된 피형 현미경에서 객관적인 렌즈를 20배 또는 40배로 조정합니다. mRFP로 표지된 정자 핵을 포함하는 ovules의 심상을 취득합니다.
배아 낭에서 mRFP 표지된 정자 핵의 수를 확인합니다. 배아 낭에서 각 mRFP 표지된 정자 핵의 모양과 위치를 확인한다. 이 연구에서는, 수정 표현형은 배란에 있는 정액 핵 신호 형태에 의해 판단되었습니다.
대부분의 난란은 계란 세포 micropylar 측 및 중앙 세포 charazal 말측에 2개의 decondensed mRFP 표지한 정액 핵을 포함했습니다. 이는 성공적인 이중 수정을 나타냅니다. 또한, 중앙 세포 핵에서 decondensed mRFP-표지된 정자 핵을 함유한 배란과 계란 세포 외부의 응축된 mRFP-표지된 정자 핵이 관찰되어 단일 수정을 나타낸다.
이중 수정이 실패하는 경우, 2개의 응축된 mRFP-표지된 정자 핵은 계란 세포와 중앙 세포의 경계에서 관찰되었다. HTR10-mRFP 꽃가루의 배경을 가진 DMP9-녹다운 라인을 이용한 분석에서, 단일 응축된 mRFP 표지된 정자 핵 또는 3개 이상의 mRFP 표지정자 핵을 함유한 배란은 거의 관찰되지 않았다. 여성 마커 라인의 사용과 결합하여 보다 정확한 수정 상태를 분석할 수 있습니다.
예를 들어, 게임트 융합 후 및 카르요가미가 판단되기 전에 의 수정 상태는 판단될 수 있다. 예, 수정 과정은 여러 단계로 나뉩니다. 이 개선된 방법으로 각 수정 조절기가 어떤 단계에 응답할 수 있는가하는 질문입니다.
그것은 식물의 성적 번식에 깊은 통찰력을 제공 할 것입니다.
