هنا، نقدم بروتوكول للكشف عن 5-هيدروكسي ميثيسيلتوسين في الخلايا وأنسجة الدماغ باستخدام immunofluorescence، والطريقة الجديدة، ولطخة نقطة الحمض النووي. 5-hydroxymethylcytosin، أي 5hmC، تعديل اللاجينية المخفف، يلعب وظيفة هامة في تنظيم التعبير الجيني والمشاركة في اضطرابات عصبية متعددة.
في الواقع، يمكن استخدام أساليبنا للكشف عن 5hmC في خلايا متعددة والأنسجة. انها مريحة ويمكن تنفيذها مع المعدات المشتركة في المختبر. تبدأ عن طريق وضع وجه الماوس حتى على لوحة من البلاستيك وتحديد كل طرف مع شريط لزجة.
استخدم مقص جراحيًا لقطع الجلد والعضلات، وفتح تجويف الصدر. كشف القلب وقطع جزء صغير من الأذين الأيمن مع مقص الجراحية غرامة. باستخدام 10 ملليلتر المتاح، معقمة حقنة، ضخ الماوس من البطين الأيسر مع برنامج تلفزيوني الباردة.
ثم، perfuse الماوس مع 4٪ PFA حتى أنها قاسية. ثم افتح الجمجمة بملباب العظام وأزل الدماغ. ضع الدماغ في أنبوب طرد مركزي 15 ملليلتر مملوء بخمسة ملليلترات من 4٪ PFA واخزنه عند أربع درجات مئوية.
بعد 24 ساعة، نقل الدماغ إلى محلول السكروز 30٪، وتركها في أربع درجات مئوية للجفاف الكامل. قبل القطاعات، تم تجميع الدماغ في مجمع درجة حرارة القطع الأمثل وبارد إلى ناقص 20 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل. عينات الدماغ المقطع بسمك 20 إلى 40 ميكرومتر باستخدام ميكروتوماتية cryostat.
جمع أقسام في برنامج تلفزيوني وتخزينها في أربع درجات مئوية. التقاط أقسام الدماغ من الفائدة ووضعها في لوحة 24-جيدا مع برنامج تلفزيوني. غسل المقاطع مع برنامج تلفزيوني على شاكر لمدة 10 دقائق.
إزالة برنامج تلفزيوني وعلاج مع مسخن حمض الهيدروكلوريك واحد المولر في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. حمض الهيدروكلوريك هو تآكل ويرجى إعداده في عقد الكيميائية. ثم، غسل العينات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق ومنعها مع برنامج تلفزيوني يحتوي على مصل الماعز العادي 3٪و 0.1٪ تريتون X-100.
اترك العينات على شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. إضافة أجسام مضادة أولية محددة إلى الأقسام واحتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية على شاكر. في اليوم التالي، أخذ العينات وتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
غسل العينات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني وإضافة الأجسام المضادة الثانوية. غطي الطبق بالألمنيوم واتركيه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة أثناء الاهتزاز. بعد الحضانة، وغسل العينات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني وجبل لهم على الشرائح.
إضافة 100 إلى 150 ميكرولتر من مضادة للتلاشي تصاعد المتوسطة، وتغطية مع غطاء قسط الزجاج، وختم مع طلاء الأظافر. صور أقسام الدماغ مع مجهر منتظم أو confocal. لعزل الحمض النووي الجينومي، ابدأ بتشريح قرن آمون والقشرة وأنسجة المخيخ على طبق مبرد بالجليد.
إضافة ملليلتر واحد من الحمض النووي العازلة وطحن الأنسجة. نقل العينة إلى أنبوبrifuge صغيرة نظيفة وإضافة 250 ميكروغرام من البروتينات-K لكل 600 ميكرولترات من عازلة تحلل. ثم، إضافة حوالي 50 ميكروغرام من RNase A لكل عينة واحتضان لمدة 12 ساعة على الأقل في 37 درجة مئوية.
بعد الحضانة، إضافة حجم متساو من الكحول ايساميل الكلوروفورم الفينول وخلطها جيدا. الطرد المركزي الخليط وفقا لاتجاهات المخطوطات ونقل نابيرنت إلى أنبوب جديد. أضف 600 ميكرولترات من الكلوروفورم إلى المُسَتَلَد، ويُخلط جيداً، والطرد المركزي وفقاً لاتجاهات المخطوطات.
نقل سوبرناتانت إلى أنبوب جديد وإضافة 500 ميكرولترات من ايزوبروبانول. اخلطي جيداً وطاردة مركزية مرة أخرى للتعجيل بالحمض النووي. بعد الطرد المركزي، والتخلص من اهب، وغسل بيليه الحمض النووي مع 70٪ الإيثانول وفقا لاتجاهات المخطوطات.
الهواء الجافة بيليه الحمض النووي تماما وبعد ذلك، حل في المخزن المؤقت تريس-HCl. قبل البدء، قم بإعداد الحلول المطلوبة وعينة الخليط وفقاً لتوجيهات المخطوطات. اِنسخ عينة الحمض النووي عن طريق تسخينها إلى 100 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ثم ضعها على الجليد
قطع الحجم المناسب من غشاء النايلون وشطفه مع 6X SSC. ضع الغشاء على جهاز نقطة لطخة وربط مضخة فراغ. بقعة ست نقاط ميكروليتر على الغشاء وتهجين لمدة 30 دقيقة في 80 درجة مئوية.
ثم، كتلة عينة الغشاء مع الحليب الخالي من الدهون والملوحة تريس المخزنة، أو TBS، لمدة ساعة واحدة. إضافة الأجسام المضادة الأرانب البولي كلينال المضادة 5-هيدروكسي ميثيليسيتوسين إلى الغشاء واحتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. في اليوم التالي، ترك غشاء العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة، ثم غسل الغشاء ثلاث مرات مع TBS.
احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة المضادة للأرانب مضادة 30 دقيقة ومن ثم، وغسل ثلاث مرات مع TBS. تصور إشارات chemiluminescence وقياسا شدتها. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتصور 5-هيدروكسي ميثيل سيتوسين، أو 5hmc، في قرن آمون من الفئران الكبار.
المناعي مع الأجسام المضادة ضد الخلايا العصبية, 5hmC يكشف أن هناك إثراء 5hmC في الخلايا العصبية. يمكن تحديد ديناميات 5hmC خلال التنمية العصبية مع اختبار نقطة لطخة من عينات الحمض النووي معزولة عن الخلايا الجذعية العصبية الكبار المتكاثرة والمتمايزة. مستويات عالمية من 5hmC زيادة كبيرة خلال التمايز ومستوى 5hmC في الخلايا العصبية أعلى مما كانت عليه في الخلايا الجذعية العصبية.
الخطوة الرئيسية لهذه الطريقة هي التأكد من أن التككر الكامل لعينات الحمض النووي.
