Aquí, presentamos un protocolo para detectar 5-hidroximetilcitosina en las células y los tejidos cerebrales usando inmunofluorescencia, el nuevo método, y la mancha de puntos de ADN. 5-hidroximetilcitosina, es decir, 5hmC, modificación epigenética mitigada, desempeña una función importante en la regulación de la expresión génica e implicado en múltiples trastornos neurológicos.
En realidad, nuestros métodos se pueden utilizar para detectar 5hmC en múltiples células y tejidos. Es conveniente y se puede realizar con equipos comunes en el laboratorio. Comience colocando el ratón boca arriba en una tabla de plástico y fijando cada extremidad con cinta adhesiva.
Usa tijeras quirúrgicas para cortar la piel y el músculo, y abre la cavidad torácica. Exponga el corazón y corte una pequeña parte de la aurícula derecha con finas tijeras quirúrgicas. Usando una jeringa desechable de 10 mililitros, perfunde el ratón del ventrículo izquierdo con PBS frío.
A continuación, perfunda el ratón con 4%PFA hasta que esté rígido. Luego, abre el cráneo con fórceps óseos y extrae el cerebro. Coloque el cerebro en un tubo centrífugo de 15 mililitros lleno de cinco mililitros de 4%PFA y guárdelo a cuatro grados centígrados.
Después de 24 horas, transfiera el cerebro a una solución de 30% sacarosa y déjelo a cuatro grados centígrados para una deshidratación completa. Antes de la sección, imbed el cerebro en un compuesto de temperatura de corte óptima y enfriar a menos 20 grados Celsius durante al menos una hora. Secciones de muestras cerebrales con un grosor de 20 a 40 micrómetros utilizando un microtoma criostato.
Recoger secciones en PBS y almacenar a cuatro grados Celsius. Recoge las secciones cerebrales de interés y colólas en una placa de 24 pozos con PBS. Lavar las secciones con PBS en una coctelera durante 10 minutos.
Retire el PBS y trate con ácido clorhídrico de un molar precalentado a 37 grados centígrados durante 30 minutos. El ácido clorhídrico es corrosivo y prepáralo en la bodega química. Luego, lave las muestras tres veces con PBS durante cinco minutos y bloquee con PBS que contenga un 3% de suero de cabra normal y un 0,1%Tritón X-100.
Deje las muestras en una coctelera a temperatura ambiente durante una hora. Añadir anticuerpos primarios específicos a las secciones e incubar durante la noche a cuatro grados Celsius en un agitador. Al día siguiente, saque las muestras y déjelas a temperatura ambiente durante una hora.
Lave las muestras tres veces con PBS y agregue anticuerpos secundarios. Cubra la placa con aluminio y déjela a temperatura ambiente durante una hora mientras agita. Después de la incubación, lave las muestras tres veces con PBS y móntelos en los portaobjetos.
Agregue de 100 a 150 microlitros de medio de montaje anti-fade, cubra con un vidrio de cubierta premium y selle con esmalte de uñas. Imagen de las secciones cerebrales con un microscopio regular o confocal. Para aislar el ADN genómico, comience diseccionando el hipocampo, la corteza y los tejidos del cerebelo en un plato refrigerado por hielo.
Añadir un mililitro de tampón de lysis de ADN y moler los tejidos. Transfiera la muestra a un tubo de microcentrífuga limpio y añada 250 microgramos de proteinasa-K por cada 600 microlitros de tampón de lelisis. Luego, agregue unos 50 microgramos de RNase A por muestra e incubar durante al menos 12 horas a 37 grados centígrados.
Después de la incubación, añadir un volumen igual de alcohol isoamilo de cloroformo fenol y mezclar a fondo. Centrifugar la mezcla de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Agregue 600 microlitros de cloroformo al sobrenadante, mezcle bien y centrifugar de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.
Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y agregue 500 microlitros de isopropanol. Mezcle bien y centrifugar de nuevo para precipitar el ADN. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y lave el pellet de ADN con 70% de etanol de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.
Seque el pellet de ADN por completo y luego disuelva en el tampón Tris-HCl. Antes de empezar, prepare las soluciones requeridas y la mezcla de muestras de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Desnaturalizar la muestra de ADN calentándola a 100 grados Celsius durante 10 minutos y luego, colóquela sobre hielo.
Corte el tamaño adecuado de una membrana de nylon y enjuáguela con 6X SSC. Coloque la membrana en un aparato de punto-blot y conecte la bomba de vacío. Detecte puntos de seis microlitros en la membrana e hibridí durante 30 minutos a 80 grados centígrados.
Luego, bloquee la membrana de la muestra con leche libre de grasa y solución salina tamponada Tris, o TBS, durante una hora. Añadir el anticuerpo anti-5-hidroximetilcitosina de conejo policlonal a la membrana e incubar durante la noche a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, deje la membrana de la muestra a temperatura ambiente durante una hora y, a continuación, lave la membrana tres veces con TBS.
Incubar la membrana con el anticuerpo secundario anti-conejo durante 30 minutos y luego, lavar tres veces con TBS. Visualizar las señales de quimiminiscencia y cuantificar su intensidad. Este protocolo se puede utilizar para visualizar 5-hidroximetilcitosina, o 5hmC, en el hipocampo de ratones adultos.
La inmunofluorescencia con anticuerpos contra las células neuronales, el 5hmC revela que hay un enriquecimiento de 5hmC en las neuronas. La dinámica de 5hmC durante el desarrollo neuronal se puede determinar con un ensayo de punto-blot de muestras de ADN aisladas de células madre neuronales adultas proliferantes y diferenciadas. Los niveles globales de 5hmC aumentan significativamente durante la diferenciación y el nivel de 5hmC en las neuronas es mayor que en las células madre neurales.
El paso clave de este método es asegurarse de que la desnaturalización completa de las muestras de ADN.
