Burada, immünoresans, yeni yöntem ve DNA nokta-blot kullanarak hücrelerde ve beyin dokularında 5-hidroksimetilitetozin tespit etmek için bir protokol sıyoruz. 5-hidroksimetilsitozin, yani 5hmC, azaltılmış epigenetik modifikasyon, gen ekspresyonunu düzenleyen önemli bir işlev oynar ve birden fazla nörolojik bozukluklar dahil.
Aslında, yöntemlerimiz birden fazla hücre ve dokularda 5hmC tespit etmek için kullanılabilir. Bu kullanışlı ve laboratuvarda ortak ekipmanları ile yapılabilir. Fareyüz plastik bir tahta üzerinde konumlandırma ve yapışkan bant ile her uzuv sabitleme ile başlayın.
Deri ve kas kesmek için cerrahi makas kullanın ve göğüs boşluğu açın. Kalbi ortaya çıkarmak ve ince cerrahi makas ile sağ atriyumun küçük bir kısmını kesti. 10 mililitrelik tek kullanımlık, sterilize şırınga kullanarak fareyi sol ventrikülden soğuk PBS ile geçirin.
Daha sonra fareyi sert olana kadar %4 PFA ile perfüzyonlayın. Sonra, kemik forceps ile kafatası açın ve beyin çıkarın. Beyni %4'lük beş mililitrelik bir santigrat ile dolu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştirin ve dört santigrat derecede saklayın.
24 saat sonra, bir 30% sakaroz çözeltisi içine beyin transferi ve tam dehidratasyon için dört derece santigrat bırakın. Kesitönce, en iyi kesme sıcaklığı bileşik beyin imbed ve eksi 20 derece santigrat en az bir saat boyunca serin. Kesit beyin örnekleri 20 ila 40 mikrometre kalınlığında bir kriyostat mikrotom kullanarak.
PBS içine bölümleri toplamak ve dört derece santigrat de saklamak. İlgi beyin bölümlerini toplayın ve PBS ile 24 kuyulu bir tabağa koyun. PBS ile bölümleri 10 dakika çalkalayıcıda yıkayın.
PBS çıkarın ve 30 dakika boyunca 37 santigrat derece önceden ısıtılmış tek molar hidroklorik asit ile tedavi. Hidroklorik asit aşındırıcıdır ve lütfen kimyasal ambarda hazırlayın. Daha sonra numuneleri beş dakika PBS ile üç kez yıkayın ve %3 normal keçi serumu ve %0.1 Triton X-100 içeren PBS ile engelleyin.
Bir saat oda sıcaklığında bir shaker üzerinde örnekleri bırakın. Bölümlere spesifik primer antikorlar ekleyin ve bir shaker üzerinde dört santigrat derece gecede kuluçka. Ertesi gün, örnekleri dışarı alın ve bir saat oda sıcaklığında bırakın.
Örnekleri PBS ile üç kez yıkayın ve ikincil antikorlar ekleyin. Alüminyum ile plaka kapağı ve sallayarak bir saat oda sıcaklığında bırakın. Kuluçkadan sonra numuneleri PBS ile üç kez yıkayın ve slaytlara monte edin.
Anti-fade montaj orta 100 ila 150 mikrolitre ekleyin, bir prim kapak cam ile kapak, ve oje ile mühür. Beyin bölümlerini düzenli veya konfokal mikroskopla görüntüleyin. Genomik DNA izole etmek için, bir buz soğutmalı çanak üzerinde hipokampus, korteks ve beyincik dokuları inceleyerek başlar.
BIR mililitre DNA lisis tamponu ekleyin ve dokuları öğütün. Numuneyi temiz bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve her 600 mikrolitre lysis tamponu için 250 mikrogram proteinaz-K ekleyin. Daha sonra, numune başına yaklaşık 50 mikrogram RNase A ekleyin ve 37 santigrat derecede en az 12 saat kuluçkaya yatırın.
Kuluçka sonra, fenol kloroform izoamyl alkol eşit hacimli ekleyin ve iyice karıştırın. Karışımı el yazması yönlere göre santrifüj edin ve süpernatantı yeni bir tüpe aktarın. Supernatant kloroform 600 mikrolitre ekleyin, iyice karıştırın ve el yazması talimatlara göre santrifüj.
Yeni bir tüp için supernatant aktarın ve izopropanol 500 mikrolitre ekleyin. Iyice karıştırın ve DNA çökelti tekrar santrifüj. Santrifüjden sonra, supernatant atın ve el yazması yönlere göre% 70 etanol ile DNA pelet yıkayın.
Hava DNA peletini tamamen kurutun ve tris-HCl tamponunda eritin. Başlamadan önce, el yazması talimatlara göre gerekli çözümleri ve örnek karışımı hazırlayın. DNA örneğini 10 dakika 100 santigrat dereceye ısıtarak denatüre edin ve sonra buzun üzerine koyun.
Bir naylon membranuygun boyutu kesin ve 6X SSC ile durun. Membranı nokta-leke li bir aparata yerleştirin ve vakum pompasını bağlayın. Altı mikrolitrelik noktaları membrana tespit edin ve 80 santigrat derecede 30 dakika melezleyin.
Daha sonra, yağsız süt ve Tris tamponlu salin veya TBS ile örnek membran blok, bir saat. Membrana poliklonal tavşan anti-5-hidroksimetilitetistosin antikor ekleyin ve dört santigrat derece gecede kuluçka. Ertesi gün, bir saat oda sıcaklığında örnek membran bırakın, sonra TBS ile membran üç kez yıkayın.
Membranı 30 dakika boyunca anti-tavşan ikincil antikorile kuluçkaya yatırın ve ardından TBS ile üç kez yıkayın. Bu protokol yetişkin farelerin hipokampus5-hidroksimetilsitozin, ya da 5hmC, görselleştirmek için kullanılabilir.
Nöronal hücrelere karşı antikorlar ile immünororesans, 5hmC nöronlarda 5hmC bir zenginleştirme olduğunu ortaya koymaktadır. Nöronal gelişim sırasında 5hmC dinamikleri çoğalan ve farklılaşmış erişkin nöral kök hücrelerden izole DNA örneklerinin nokta-leke testi ile belirlenebilir. 5hmC küresel düzeyleri önemli ölçüde farklılaşma sırasında artış ve nöronlarda 5hmC düzeyi nöral kök hücrelere göre daha yüksektir.
Bu yöntemin temel adımı DNA örneklerinin tam denatürasyonu emin olmaktır.
