Qui presentiamo un protocollo per rilevare la 5-idrossimetilcitosina nelle cellule e nei tessuti cerebrali usando l'immunofluorescenza, il nuovo metodo e il DNA dot-blot. La 5-idrossimetilcitosina, cioè 5hmC, modifica epigenetica mitigata, svolge una funzione importante nella regolazione dell'espressione genica e coinvolta in molteplici disturbi neurologici.
In realtà, i nostri metodi possono essere utilizzati per rilevare 5hmC in più cellule e tessuti. È conveniente e può essere eseguito con attrezzature comuni in laboratorio. Inizia posizionando il mouse a faccia in su su una tavola di plastica e fissando ogni arto con nastro adesivo.
Utilizzare forbici chirurgiche per tagliare la pelle e il muscolo e aprire la cavità toracica. Esporre il cuore e tagliare una piccola parte dell'atrio destro con forbici chirurgiche fini. Utilizzando una siringa sterilizzata monouso da 10 millilitri, perfondere il mouse dal ventricolo sinistro con PBS freddo.
Quindi, perfondere il mouse con il 4%PFA fino a quando non è rigido. Quindi, apri il cranio con le forcep ossee e rimuovi il cervello. Mettere il cervello in un tubo di centrifuga da 15 millilitri riempito con cinque millilitri del 4% di PFA e conservarlo a quattro gradi Celsius.
Dopo 24 ore, trasferire il cervello in una soluzione di saccarosio al 30% e lasciarlo a quattro gradi Celsius per una completa disidratazione. Prima di sezionamento, ho incitato il cervello in un composto ottimale della temperatura di taglio e raffreddato a meno 20 gradi Celsius per almeno un'ora. Se sezione campioni cerebrali ad uno spessore da 20 a 40 micrometri utilizzando un microtomo criostato.
Raccogliere sezioni in PBS e archiviare a quattro gradi Celsius. Raccogli le sezioni cerebrali di interesse e mettile in una piastra da 24 po 'con PBS. Lavare le sezioni con PBS su uno shaker per 10 minuti.
Rimuovere il PBS e trattare con acido cloridrico monomolare preriscaldato a 37 gradi Celsius per 30 minuti. L'acido cloridrico è corrosivo e si prega di prepararlo nella stiva chimica. Quindi, lavare i campioni tre volte con PBS per cinque minuti e bloccarli con PBS contenente il 3% di siero di capra normale e lo 0,1%Triton X-100.
Lasciare i campioni su uno shaker a temperatura ambiente per un'ora. Aggiungere anticorpi primari specifici alle sezioni e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius su uno shaker. Il giorno dopo, prelevare i campioni e lasciarli a temperatura ambiente per un'ora.
Lavare i campioni tre volte con PBS e aggiungere anticorpi secondari. Coprire la piastra con alluminio e lasciarla a temperatura ambiente per un'ora mentre si trema. Dopo l'incubazione, lavare i campioni tre volte con PBS e montarli su diapositive.
Aggiungere da 100 a 150 microlitri di mezzo di montaggio anti-dissolvenza, coprire con un vetro di copertura premium e sigillare con smalto per unghie. Immagini le sezioni cerebrali con un microscopio regolare o confocale. Per isolare il DNA genomico, inizia sezionando i tessuti dell'ippocampo, della corteccia e del cervelletto su un piatto raffreddato a ghiaccio.
Aggiungere un millilitro del tampone di lysis del DNA e macinare i tessuti. Trasferire il campione in un tubo di microcentrifugo pulito e aggiungere 250 microgrammi di proteinasi-K per ogni 600 microlitri di tampone di lysis. Quindi, aggiungere circa 50 microgrammi di RNasi A per campione e incubare per almeno 12 ore a 37 gradi Celsius.
Dopo l'incubazione, aggiungere un volume uguale di fenolo cloroformio alcol isoamlico e mescolare accuratamente. Centrifugare la miscela secondo le indicazioni manoscritte e trasferire il supernatante su un nuovo tubo. Aggiungere 600 microlitri di cloroformio al supernatante, mescolare accuratamente e centrifugare secondo le indicazioni manoscritte.
Trasferire il supernatante su un nuovo tubo e aggiungere 500 microlitri di isopropanolo. Mescolare accuratamente e centrifugare di nuovo per far precipitare il DNA. Dopo la centrifugazione, scartare il supernatante e lavare il pellet di DNA con il 70% di etanolo secondo le indicazioni del manoscritto.
Asciugare completamente il pellet di DNA e quindi scioglierlo nel tampone Tris-HCl. Prima di iniziare, preparare le soluzioni richieste e la miscela di campioni in base alle indicazioni manoscritte. Denaturare il campione di DNA riscaldarlo a 100 gradi Celsius per 10 minuti e quindi posizionarlo sul ghiaccio.
Tagliare le dimensioni appropriate di una membrana di nylon e risciacquarla con 6X SSC. Posizionare la membrana su un apparato a macchie di punti e collegare la pompa per vuoto. Individuare punti a sei microliter sulla membrana e ibridare per 30 minuti a 80 gradi Celsius.
Quindi, bloccare la membrana del campione con latte privo di grassi e soluzione salina tamponata tris, o TBS, per un'ora. Aggiungere l'anticorpo anti-5-idrossimetilcitosina del coniglio policlonale alla membrana e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, lasciare la membrana campione a temperatura ambiente per un'ora, quindi lavare la membrana tre volte con TBS.
Incubare la membrana con l'anticorpo secondario anti-coniglio per 30 minuti e quindi lavare tre volte con TBS. Visualizzare i segnali di chemiluminescenza e quantificarne l'intensità. Questo protocollo può essere utilizzato per visualizzare la 5-idrossimetilcitosina, o 5hmC, nell'ippocampo dei topi adulti.
Immunofluorescenza con anticorpi contro le cellule neuronali, il 5hmC rivela che c'è un arricchimento di 5hmC nei neuroni. La dinamica di 5hmC durante lo sviluppo neuronale può essere determinata con un saggio dot-blot di campioni di DNA isolati da cellule staminali neurali adulte proliferano e differenziate. I livelli globali di 5hmC aumentano significativamente durante la differenziazione e il livello di 5hmC nei neuroni è più alto che nelle cellule staminali neurali.
Il passaggio chiave di questo metodo è assicurarsi che la denaturazione completa dei campioni di DNA.
