转化、基因组编辑和拟合氮的热带大麻树帕拉斯波尼亚安德森

帕拉斯波尼亚是一种热带树从大麻家族，能够建立一个氮固定共生与rhizobium。帕拉斯波尼亚和豆类之间的比较研究可以为研究根共生的核心遗传网络提供见解。有了这个协议，帕拉斯帕尼亚安德森尼稳定的转基因突变线可以在两到三个月内产生。

这些线可以通过体外传播有效地传播。该协议提供了一个实验平台，研究根系共生以及该热带树生物学的其他方面。组织培养和分子克隆的基本技能足以实施此协议。

这使得任何实验室都能够将帕拉斯波尼亚作为研究模型。演示该程序将由博士生蒂蒂斯·瓦尔达尼和尤达·罗斯万贾亚以及我们实验室的技术人员玛丽克·哈托格一起演示。要种植帕拉斯波尼亚安德森树，首先发芽的种子。

通过摩擦茶筛内部或压在一张纸巾上，从帕拉斯波尼亚浆果中去除种子。使用4%次氯酸盐漂白剂消毒种子15至20分钟，然后用消毒水清洗种子6次。将种子转移到无菌的200微升PCR管中，用消毒水填充管子以淹没种子。

根据手稿指示，在热循环器中孵育管10天。经过10天的孵育，将种子转移到SH-0板，并关闭他们两层弹性密封箔，以防止干燥。在28摄氏度下孵育，白天16小时，夜间周期为3至4周。

一旦幼苗发展出第一组真叶，将它们转移到装满商业盆栽的盆栽，并覆盖他们一个半透明的塑料杯，以防止干燥。将锅放在28摄氏度、85%的相对湿度气候室或温室中，在16小时白天，8小时夜间的气候下。一周后，取出塑料杯。

定期给锅浇水，补充肥料来维持树木的生长。通过从温室种植的树木中收获五到八厘米的年轻树枝来准备改造，确保只使用健康的、未受感染的树枝。切掉叶子，在每个小动物的末尾留下一厘米平方的叶子组织。

用含有几滴多糖酸酯20的2%次氯酸盐漂白剂对组织进行15分钟的消毒，然后用自洗水冲洗8次。将25毫升的渗透介质中再悬浮的农业细菌细胞的光学密度约为5。将茎和宠物组织切成细胞悬浮液内的一厘米碎片。

取出叶组织，孵育细胞悬浮液中的茎和小片，10至30分钟。将纸巾片擦干无菌滤纸，并放在根据手稿指示准备的生根介质上。在黑暗中孵育板在21摄氏度，两天。

两天后，检查板材有无真菌或细菌污染，并丢弃受污染的板材。将组织片段转移到10毫升SH-10培养的根据手稿指示准备。将组织留在培养器中至少10分钟，每两到三分钟轻轻搅拌一次进行清洗。

根据手稿指示准备用 cefotaxime 和 kanamycin 的根介质， 并倒板。干燥无菌滤纸上的组织，然后转移到板上。在16小时白天，8小时夜间的方案下，在28摄氏度下孵育7天。

每两天检查一次真菌或细菌污染的板。如果发生污染，将未受感染的组织件转移到新鲜板中。七天后，将组织片段转移到根据手稿指示准备的传播介质，并在28摄氏度下在16小时白天、8小时夜间的培养下孵育。

每周刷新一次板，直到转基因芽发展，确保只将未受感染的组织片转移到新的盘子。一旦放生转基因芽至少一厘米长，切开芽，并在抗生素的传播媒介中独立培养。为了确保拍摄代表独立的变换者，仅从外植的每一侧拍摄一次。

通过将大约 10 个芽放在新的传播介质板上，用两层弹性密封箔关闭板来传播组织。在16小时白天，8小时夜间的方案下，在28摄氏度下孵育盘子，每四周重复一次这一步骤。当芽达到一厘米长时，切开它们在基地，并把它们放在根介质上。

通过将射片的基底尖端插入介质，将射片竖直放置。一个板上可以放置大约 10 个芽。首先准备铀。

从一个多发性BOR2的单一群落中接种10毫升的液体YEM介质，并在28摄氏度下孵育两天。使用此培养剂为较大体积的液体 YEM 介质接种。一旦生长，将细菌培养在3，500倍g下离心10分钟，以收获细胞。

将细菌颗粒重新悬浮在液体EKM介质中，并确定光学密度。准备三升EKM介质，这足以约20盆，并接种与rhizobial悬浮液。将介质与 1.25 千克微石混合，并将 210 克这种混合物加入无菌半透明聚丙烯罐中。

将一到三个帕拉斯波尼亚安德森植物植物种植到每个盆中，并准备几个盆，用控制结构进行转化。称重几个锅，并覆盖每个锅的底部，以保护根免受光照射。在16小时、8小时夜间的高温下，在28摄氏度的气候生长室中孵育盆，为期4至6周。

每周一次，称几壶来确定水损失。如果水损失超过10毫升，补充超纯水，以弥补损失。孵育后，从白石中清洁根部，并使用双筒望远镜确定结核数。

该技术已被用来成功地转化了帕拉斯波尼亚安德森茎与农业细菌株AGL1的皮奥耳和部分。首先，组织外植与农业细菌共同培养两天。长时间的共培养会导致细菌过度殖民化，应防止这种过度培养。

几周后，沿着原来的伤口表面观察到小的绿色微卡利。这些卡利继续增长和开发一个或多个经过改造的芽，在六到八周后开始转换。从成熟分支的组织外植到 65 到 75% 的年轻和快速增长的分支的组织外植，转化效率从 10% 到 30% 不等。

转基因芽可以通过体外繁殖成倍增加，在一个月内产生数十种芽。这些芽可以放在根介质上，在两周内诱导根的形成，并产生可用于实验的植物。在开始稳定的变换实验时，选择健康的分支作为源材料非常重要。

帕拉斯波尼亚T0转基因线在体外传播。因此，必须彻底基因型帕拉斯波尼亚转基因线。建立帕拉斯波尼亚作为实验模型允许比较分析两个遥远的相关的结点血统，帕拉斯波尼亚和豆类。

这可以识别保存遗传网络的基础rhizobium共生。帕拉斯波尼亚也可以是研究其他研究课题的宝贵模型，如木材形成、双性恋花卉的发展，或卡纳巴西特异性二次代谢物的生物合成。