Parasponia é uma árvore tropical da família Cannabis que é capaz de estabelecer uma simbiose fixador de nitrogênio com rizobium. Estudos comparativos entre parasponia e leguminosas poderiam fornecer insights sobre as redes genéticas centrais subjacentes à simbiose do rizobito. Com este protocolo, as linhas mutantes transgênicas estáveis de Parasponia andersonii podem ser geradas em um período de dois a três meses.
Estas linhas podem ser propagadas eficientemente através da propagação in vitro. Este protocolo fornece uma plataforma experimental para estudar a simbiose rizobial, bem como outros aspectos da biologia desta árvore tropical. Habilidades básicas na cultura tecidual e clonagem molecular são suficientes para implementar este protocolo.
Isso permite que qualquer laboratório adapte a Parasponia como modelo de pesquisa. Demonstrando o procedimento serão os doutorandos Titis Wardhani e Yuda Roswanjaya, juntamente com Marijke Hartog, técnica do nosso laboratório. Para cultivar árvores parasponia andersonii, comece germinando as sementes.
Remova as sementes das frutas parasponia esfregando contra o interior de uma peneira de chá ou esmagando-as em um pedaço de papel de tecido. Desinfetar as sementes usando alvejante de 4% de hipoclorito por 15 a 20 minutos e, em seguida, lave as sementes seis vezes com água esterilizada. Transfira as sementes para tubos PCR de 200 microliter e encha os tubos com água esterilizada para submergir as sementes.
Incubar os tubos por 10 dias em um termociclador de acordo com as instruções do manuscrito. Após a incubação de 10 dias, transfira as sementes para placas SH-0 e feche-as com duas camadas de papel alumínio elástico para evitar a secagem. Incubar a 28 graus Celsius com um ciclo de 16 horas por dia e oito horas noturnas durante três a quatro semanas.
Uma vez que as mudas desenvolvam seu primeiro conjunto de folhas verdadeiras, transfira-as para potes cheios de solo comercial de vasos, e cubra-as com um copo de plástico translúcido para evitar a dessecação. Coloque os potes em uma sala climática de 28 graus Celsius, 85% de umidade relativa ou estufa sob um regime de 16 horas por dia, oito horas noturnas. Depois de uma semana, retire o copo de plástico.
Regar regularmente os potes e complementar com fertilizante para sustentar o crescimento das árvores. Prepare-se para a transformação colhendo galhos jovens de cinco a oito centímetros das árvores cultivadas em estufa, certificando-se de usar apenas galhos saudáveis e não infectados. Corte as folhas, deixando um centímetro quadrado de tecido de folha no final de cada petiole.
Desinfete o tecido por 15 minutos com alvejante de hipoclorito de 2% contendo algumas gotas de polisorbato 20, e depois enxágüe-o oito vezes com água autoclavada. Suspenda as células agrobacterium em 25 mililitros de meio de infiltração a uma densidade óptica de cerca de cinco. Corte a haste e o tecido petiole em pedaços de um centímetro dentro da suspensão celular.
Remova os tecidos da folha e incuba as peças de caule e petiole na suspensão celular por 10 a 30 minutos. Seque os pedaços dos tecidos em um pedaço estéril de papel filtro e coloque-os no meio de enraizamento preparado de acordo com as instruções do manuscrito. Incubar as placas no escuro a 21 graus Celsius por dois dias.
Após os dois dias, inspecione as placas para contaminação fúngica ou bacteriana e descarte placas contaminadas. Transfira as peças teciduais para 10 mililitros de meio SH-10 preparados de acordo com as instruções do manuscrito. Deixe o tecido no meio por pelo menos 10 minutos e agitar suavemente a cada dois ou três minutos para lavar.
Prepare o meio de enraizamento com cefotaxime e kanamycina de acordo com as instruções do manuscrito, e despeje placas. Seque os tecidos em pedaços estéreis de papel filtro e transfira-os para as placas. Incubar placas por sete dias a 28 graus Celsius sob um regime de 16 horas diárias e oito horas noturnas.
Verifique as placas quanto à contaminação fúngica ou bacteriana a cada dois dias. Se ocorrer contaminação, transfira os pedaços de tecido não infectado para uma placa fresca. Após sete dias, transfira as peças teciduais para o meio de propagação preparado de acordo com as instruções do manuscrito e incubar a 28 graus Celsius sob um regime de 16 horas por dia, oito horas noturnas.
Atualize as placas uma vez por semana até que as filmagens transgênicas se desenvolvam, certificando-se de transferir apenas pedaços de tecido não infectados para novas placas. Uma vez que os brotos transgênicos putativos têm pelo menos um centímetro de comprimento, corte os brotos e cultue-os independentemente em meio de propagação com antibióticos. Para garantir que as filmagens representem transformadores independentes, leve apenas uma única filmagem de cada lado de uma explanta.
Propague o tecido colocando cerca de 10 brotos em uma placa fresca de meio de propagação e fechando a placa com duas camadas de folha de vedação elástica. Incubar as placas a 28 graus Celsius sob um regime de 16 horas diárias e oito horas noturnas, e repetir este passo a cada quatro semanas. Quando os tiros atingirem um centímetro de comprimento, corte-os em sua base e coloque-os no meio de enraizamento.
Posicione os tiros eretos inserindo a ponta basal do tiro no meio. Cerca de 10 tiros podem ser colocados em uma única placa. Comece preparando o rizobium inóculo.
Inocular 10 mililitros de meio yem líquido de uma única colônia de Mesorhizobium plurifarium BOR2, e incubar a 28 graus Celsius por dois dias. Use esta cultura para inocular um volume maior de meio YEM líquido. Uma vez crescido, centrifugar a cultura bacteriana por 10 minutos a 3.500 vezes g para colher as células.
Suspenda a pelota bacteriana no meio líquido EKM e determine a densidade óptica. Prepare três litros de meio EKM, o que é suficiente para cerca de 20 potes, e inocula-o com a suspensão rizobial. Misture o meio com 1,25 kg de perlite e adicione 210 gramas dessa mistura a potes de polipropileno translúcido estéreis.
Plante de um a três plantatos paraenses andersonii em cada vaso, e prepare vários vasos com plantais transformados com a construção de controle. Pese vários dos potes e cubra o fundo de cada panela para proteger as raízes da exposição à luz. Incubar os potes em uma sala de crescimento climatizada a 28 graus Celsius sob um regime de 16 horas por dia, oito horas noturnas por quatro a seis semanas.
Uma vez por semana, pese vários potes para determinar a perda de água. Se a perda de água exceder 10 mililitros, suplemente com água ultra-pura para compensar a perda. Após a incubação, limpe as raízes do perlite e determine números de nódulos usando um binóculo.
Esta técnica tem sido usada para transformar com sucesso petioles e segmentos de parasponia andersonii hastes com cepa agrobacterium AGL1. Primeiro, as explantas teciduais são co-cultivadas com Agrobacterium por dois dias. O co-cultivo prolongado resulta em supercolonização bacteriana e deve ser evitado.
Algumas semanas depois, pequenos micro-callis verdes são observados ao longo da superfície original da ferida. Esses cali continuam a crescer e desenvolver uma ou mais brotos putativamente transformados em seis a oito semanas após o início da transformação. As eficiências de transformação variam de 10 a 30% para explantes teciduais de ramos maduros a 65 a 75% para explantes teciduais de ramos jovens e de rápido crescimento.
Os brotos transgênicos podem ser multiplicados através da propagação in vitro, o que dá origem a dezenas de brotos dentro de um mês. Estas brotos podem ser colocadas em meio de enraizamento que induzirá a formação de raízes em cerca de duas semanas e produzirá plantas que podem ser usadas para experimentação. Ao iniciar um experimento de transformação estável, é importante selecionar ramos saudáveis como material de origem.
Linhas transgênicas Parasponia T0 são propagadas in vitro. Portanto, é essencial genótipo completamente linhas transgênicas parasponia. O estabelecimento da Parasponia como modelo experimental permite a análise comparativa entre duas linhagens nodulativas distantes, Parasponia e leguminosas.
Isso poderia identificar redes genéticas que subjacentes à simbiose rizobium. A parasponia também pode ser um modelo valioso para estudar outros tópicos de pesquisa, como a formação de madeira, o desenvolvimento de flores bissexuais ou a biossíntese de metabólitos secundários específicos de Cannabaceae.
