Parasponia ist ein tropischer Baum aus der Cannabis-Familie, der in der Lage ist, eine stickstofffixende Symbiose mit Rhizobium herzustellen. Vergleichende Studien zwischen Parasponia und Hülsenfrüchte könnten Einen Einblick in die genetischen Kernnetzwerke der Rhizobiumsymbiose geben. Mit diesem Protokoll können Parasponia andersonii stabile transgene mutierte Linien in einem Zeitraum von zwei bis drei Monaten erzeugt werden.
Diese Linien können effizient durch In-vitro-Vermehrung vermehrt werden. Dieses Protokoll bietet eine experimentelle Plattform, um rhizobiale Symbiose sowie andere Aspekte der Biologie dieses tropischen Baumes zu studieren. Grundkenntnisse in Gewebekultur und molekularem Klonen reichen aus, um dieses Protokoll umzusetzen.
Dies ermöglicht es jedem Labor, Parasponia als Forschungsmodell anzupassen. Die Doktoranden Titis Wardhani und Yuda Roswanjaya werden zusammen mit Marijke Hartog, einer Technikerin in unserem Labor, das Verfahren demonstrieren. Um Parasponia andersonii Bäume anzubauen, beginnen Sie mit dem Keimen der Samen.
Entfernen Sie die Samen von Parasponia Beeren, indem Sie an der Innenseite eines Teesiebes reiben oder sie auf ein Stück Tissuepapier zerquetschen. Desinfizieren Sie Die Samen mit 4% Hypochlorit-Bleichmittel für 15 bis 20 Minuten, und waschen Sie die Samen dann sechsmal mit sterilisiertem Wasser. Übertragen Sie die Samen in sterile 200 Mikroliter PCR-Röhren und füllen Sie die Rohre mit sterilisiertem Wasser, um die Samen zu untertauchen.
Inkubieren Sie die Rohre für 10 Tage in einem Thermocycler nach Manuskriptanweisungen. Nach der 10-tägigen Inkubation die Samen auf SH-0-Platten übertragen und mit zwei Schichten elastischer Dichtfolie schließen, um ein Trocknen zu verhindern. Inkubieren Bei 28 Grad Celsius mit einem 16-Stunden-Tag, acht-Stunden-Nacht-Zyklus für drei bis vier Wochen.
Sobald die Sämlinge ihre ersten echten Blätter entwickeln, übertragen Sie sie in Töpfe, die mit kommerziellen Blumenerde gefüllt sind, und bedecken Sie sie mit einem durchscheinenden Plastikbecher, um ausweichenzu vermeiden. Legen Sie die Töpfe in einem 28-Grad-Celsius, 85% relative Luftfeuchtigkeit Klimaraum oder Gewächshaus unter einem 16-Stunden-Tag, acht-Stunden-Nacht-Regime. Nach einer Woche den Plastikbecher entfernen.
Regelmäßig die Töpfe gießen und mit Dünger ergänzen, um das Baumwachstum zu erhalten. Bereiten Sie sich auf die Transformation vor, indem Sie junge Fünf- bis Achtzentimeter-Zweige von den gewächseigenen Bäumen ernten und sicherstellen, dass nur gesunde, nicht infizierte Zweige verwendet werden. Schneiden Sie die Blätter ab und lassen Sie einen Zentimeter Blattgewebe am Ende jeder Blatthaut.
Desinfizieren Sie das Gewebe 15 Minuten lang mit 2% Hypochloritbleichmittel, die ein paar Tropfen Polysorbat 20 enthalten, und spülen Sie es dann achtmal mit autoklaviertem Wasser ab. Agrobacterium-Zellen in 25 Milliliter infiltrationsmedium auf eine optische Dichte von etwa fünf zurücksetzen. Schneiden Sie den Stiel und das Blattgewebe in ein Zentimeter große Stücke innerhalb der Zellsuspension.
Entfernen Sie das Blattgewebe und inkubieren Sie den Stamm und die Blattstücke in der Zellsuspension für 10 bis 30 Minuten. Trocknen Sie die Gewebestücke auf einem sterilen Stück Filterpapier und legen Sie sie auf ein Verwurzelmedium, das nach Manuskriptanweisungen zubereitet wird. Bebrüte die Platten im Dunkeln zwei Tage lang bei 21 Grad Celsius.
Nach den zwei Tagen die Platten auf Pilz- oder Bakterienkontamination untersuchen und kontaminierte Platten entsorgen. Übertragen Sie die Gewebestücke auf 10 Milliliter SH-10 Medium, die nach Manuskriptanweisungen hergestellt werden. Lassen Sie das Gewebe im Medium für mindestens 10 Minuten, und sanft alle zwei bis drei Minuten zum Waschen rühren.
Bereiten Sie Verwurzelungsmedium mit Cefotaxaund und Kanamycin nach den Manuskriptrichtungen vor und gießen Sie Platten. Trocknen Sie das Gewebe auf sterilen Stücken Filterpapier und geben Sie es auf die Platten. Inkubieren Sie Teller für sieben Tage bei 28 Grad Celsius unter einem 16-Stunden-Tag, acht Stunden-Nacht-Regime.
Überprüfen Sie die Platten alle zwei Tage auf Pilz- oder Bakterienkontamination. Wenn eine Kontamination auftritt, übertragen Sie die nicht infizierten Gewebestücke auf eine frische Platte. Nach sieben Tagen die Gewebestücke auf das nach Manuskriptanweisungen vorbereitete Vermehrungsmedium übertragen und bei 28 Grad Celsius unter einem 16-Stunden-Tag, acht Stunden-Nacht-Regime brüten.
Erfrischen Sie die Platten einmal pro Woche, bis sich transgene Triebe entwickeln, und stellen Sie sicher, dass sie nur nicht infizierte Gewebestücke auf neue Platten übertragen. Sobald die vermeintlichen transgenen Triebe mindestens einen Zentimeter lang sind, schneiden Sie die Triebe und kultivieren sie unabhängig voneinander im Vermehrungsmedium mit Antibiotika. Um sicherzustellen, dass die Triebe unabhängige Transformanten darstellen, nehmen Sie nur einen einzigen Trieb von jeder Seite einer Explantation.
Vermehren Sie das Gewebe, indem Sie etwa 10 Triebe auf eine frische Platte aus Vermehrungsmedium legen und die Platte mit zwei Schichten elastischer Dichtfolie verschließen. Inkubieren Sie die Platten bei 28 Grad Celsius unter einem 16-Stunden-Tag, acht Stunden-Nacht-Regime, und wiederholen Sie diesen Schritt alle vier Wochen. Wenn die Triebe einen Zentimeter lang werden, schneiden Sie sie an ihrer Basis und legen Sie sie auf das Wurzelmedium.
Positionieren Sie die Triebe aufrecht, indem Sie die Basalspitze des Triebes in das Medium einfügen. Etwa 10 Triebe können auf eine einzelne Platte gelegt werden. Beginnen Sie mit der Zubereitung von Rhizobium inoculum.
Impfen Sie 10 Milliliter flüssiges YEM-Medium aus einer einzigen Kolonie von Mesorhizobium plurifarium BOR2 und brüten Sie zwei Tage lang bei 28 Grad Celsius. Verwenden Sie diese Kultur, um ein größeres Volumen an flüssigem YEM-Medium zu impfen. Einmal angebaut, zentrifugieren Sie die Bakterienkultur für 10 Minuten bei 3, 500 mal g, um die Zellen zu ernten.
Setzen Sie das bakterielle Pellet in flüssigem EKM-Medium wieder auf und bestimmen Sie die optische Dichte. Bereiten Sie drei Liter EKM Medium, das reicht für etwa 20 Töpfe, und impfen Sie es mit der rhizobialsuspension. Mischen Sie das Medium mit 1,25 Kilogramm Perlit und fügen Sie 210 Gramm dieser Mischung zu sterilen transluzenten Polypropylen-Töpfen hinzu.
Pflanzen Sie ein bis drei Parasponia andersonii Pflanzen in jeden Topf und bereiten Sie mehrere Töpfe mit Pflanzen, die mit dem Kontrollkonstrukt umgewandelt wurden. Wiegen Sie mehrere der Töpfe und bedecken Sie den Boden jedes Topfes, um die Wurzeln vor Lichteinwirkung zu schützen. Inkubieren Sie die Töpfe in einem klimatisierten Wachstumsraum bei 28 Grad Celsius unter einem 16-Stunden-Tag, acht Stunden-Nacht-Regime für vier bis sechs Wochen.
Einmal pro Woche mehrere Töpfe wiegen, um Wasserverlust zu bestimmen. Wenn der Wasserverlust 10 Milliliter übersteigt, ergänzen Sie mit reinem reinem Wasser, um den Verlust zu kompensieren. Reinigen Sie nach der Inkubation die Wurzeln von Perlit und bestimmen Sie die Knöttelzahlen mit einem Fernglas.
Diese Technik wurde verwendet, um Petioles und Segmente von Parasponia andersonii Stielen mit Agrobacterium-Stamm AGL1 erfolgreich zu transformieren. Zunächst werden die Gewebeexplantationen zwei Tage lang mit Agrobacterium kokultiviert. Längere Kokultivierung führt zu einer bakteriellen Überbesiedlung und sollte verhindert werden.
Ein paar Wochen später werden entlang der ursprünglichen Wundoberfläche kleine grüne Mikro-Calli beobachtet. Diese Calli wachsen weiter und entwickeln sechs bis acht Wochen nach Beginn der Transformation einen oder mehrere vermeintlich transformierte Triebe. Die Transformationseffizienz schwankt zwischen 10 und 30 % bei Gewebeexpflanzen aus reifen Zweigen bis zu 65 bis 75 % bei Gewebeexplanten aus jungen und schnell wachsenden Zweigen.
Transgene Triebe können durch In-vitro-Vermehrung multipliziert werden, was innerhalb eines Monats zu Dutzenden von Trieben führt. Diese Triebe können auf Wurzelmedium platziert werden, die Wurzelbildung in etwa zwei Wochen induzieren und pflanzen ergeben, die für Experimente verwendet werden können. Beim Starten eines stabilen Transformationsexperiments ist es wichtig, gesunde Zweige als Ausgangsmaterial auszuwählen.
Transgene Parasponia T0-Linien werden in vitro vermehrt. Daher ist es wichtig, den Parasponia-Transgenen gründlich zu genotypisieren. Die Etablierung von Parasponia als experimentelles Modell ermöglicht eine vergleichende Analyse zwischen zwei entfernt verwandten nodulating Lineages, Parasponia und Hülsenfrüchte.
Dies könnte konservieren genetische Netzwerke zugrunde Rhizobium Symbiose identifizieren. Parasponia kann auch ein wertvolles Modell sein, um andere Forschungsthemen wie Holzbildung, die Entwicklung von bisexuellen Blüten oder die Biosynthese von Cannabaceae-spezifischen sekundären Metaboliten zu studieren.
