Parasponia est un arbre tropical de la famille cannabis qui est capable d’établir une symbiose fixatrice d’azote avec du rhizobium. Des études comparatives entre Parasponia et légumineuses pourraient fournir un aperçu des principaux réseaux génétiques sous-jacents à la symbiose rhizobium. Avec ce protocole, parasponia andersonii lignées mutantes transgéniques stables peuvent être générés dans une période de deux à trois mois.
Ces lignées peuvent être propagées efficacement par propagation in vitro. Ce protocole fournit une plate-forme expérimentale pour étudier la symbiose rhizobiale ainsi que d’autres aspects de la biologie de cet arbre tropical. Les compétences de base en culture tissulaire et en clonage moléculaire sont suffisantes pour mettre en œuvre ce protocole.
Cela permet à n’importe quel laboratoire d’adapter Parasponia comme modèle de recherche. Les doctorants Titis Wardhani et Yuda Roswanjaya ainsi que Marijke Hartog, technicienne dans notre laboratoire, démontreront la procédure. Pour faire pousser des arbres Parasponia andersonii, commencez par germer les graines.
Retirer les graines des baies de Parasponia en frottant contre l’intérieur d’un tamis à thé ou en les écraser sur un morceau de papier de soie. Désinfecter les graines à l’aide de 4 % d’eau de Javel hypochlorite pendant 15 à 20 minutes, puis laver les graines six fois avec de l’eau stérilisée. Transférer les graines dans des tubes PCR stériles de 200 microlitres et remplir les tubes d’eau stérilisée pour submerger les graines.
Incuber les tubes pendant 10 jours dans un thermocycleur selon les instructions manuscrites. Après l’incubation de 10 jours, transférer les graines dans des plaques SH-0 et les fermer avec deux couches de papier d’étanchéité élastique pour éviter le séchage. Incubez à 28 degrés Celsius avec un cycle de 16 heures par jour et huit heures de nuit pendant trois à quatre semaines.
Une fois que les semis développent leur premier ensemble de vraies feuilles, transférez-les dans des pots remplis de terre de mise en pot commerciale, et couvrez-les d’une tasse en plastique translucide pour empêcher la dessication. Placez les pots dans un climat d’humidité relative de 28 degrés Celsius et 85 % sous un régime de 16 heures par jour et huit heures par nuit. Après une semaine, retirer la tasse en plastique.
Arrosez régulièrement les pots et complétez-les avec de l’engrais pour soutenir la croissance des arbres. Préparez-vous à la transformation en récoltant de jeunes branches de cinq à huit centimètres des arbres cultivés en serre, en vous assurant d’utiliser uniquement des branches saines et non infectées. Couper les feuilles, en laissant un centimètre carré de tissu folilaire à l’extrémité de chaque pétiole.
Désinfecter le tissu pendant 15 minutes avec 2% d’eau de Javel hypochlorite contenant quelques gouttes de polysorbate 20, puis rincer huit fois avec de l’eau autoclavée. Suspendre à nouveau les cellules agrobactériennes en 25 millilitres de milieu d’infiltration à une densité optique d’environ cinq. Couper la tige et le tissu pétiole en morceaux d’un centimètre à l’intérieur de la suspension cellulaire.
Retirer les tissus foliaire et incuber les morceaux de tige et de pétiole dans la suspension cellulaire pendant 10 à 30 minutes. Séchez les morceaux de tissus sur un morceau stérile de papier filtre et placez-les sur un support d’enracinement préparé selon les directives manuscrites. Incuber les plaques dans le noir à 21 degrés Celsius pendant deux jours.
Après les deux jours, inspecter les plaques à la recherche d’une contamination fongique ou bactérienne et jeter les plaques contaminées. Transférer les morceaux de tissu à 10 millilitres de SH-10 moyen préparé selon les instructions manuscrites. Laisser le tissu dans le milieu pendant au moins 10 minutes, et agiter doucement toutes les deux à trois minutes pour se laver.
Préparer le milieu d’enracinement avec le céfotaxime et la kanamycine selon les instructions manuscrites, et verser les assiettes. Séchez les tissus sur des morceaux stériles de papier filtre et transférez-les dans les assiettes. Incuber les plaques pendant sept jours à 28 degrés Celsius sous un régime de 16 heures par jour et huit heures de nuit.
Vérifiez la contamination fongique ou bactérienne tous les deux jours. En cas de contamination, transférer les morceaux de tissus non infectés dans une assiette fraîche. Après sept jours, transférer les morceaux de tissu au milieu de propagation préparé selon les instructions manuscrites et incuber à 28 degrés Celsius sous un régime de 16 heures par jour et huit heures de nuit.
Rafraîchir les plaques une fois par semaine jusqu’à ce que les pousses transgéniques se développent, en s’assurant de ne transférer que des morceaux de tissus non infectés dans de nouvelles plaques. Une fois que les pousses transgéniques putatives font au moins un centimètre de long, coupez les pousses et culturez-les indépendamment dans le milieu de propagation avec des antibiotiques. Pour s’assurer que les pousses représentent des transformateurs indépendants, ne prenez qu’une seule pousse de chaque côté d’une explantation.
Propagez le tissu en plaçant environ 10 pousses sur une plaque fraîche de milieu de propagation et en fermant la plaque avec deux couches de papier d’étanchéité élastique. Incuber les plaques à 28 degrés Celsius sous un régime de 16 heures par jour, huit heures de nuit, et répéter cette étape toutes les quatre semaines. Lorsque les pousses atteignent un centimètre de longueur, coupez-les à leur base et placez-les sur le milieu d’enracinement.
Placez les pousses à la verticale en insérant la pointe basale de la pousse dans le milieu. Environ 10 pousses peuvent être placées sur une seule plaque. Commencez par préparer le rhizobium inoculum.
Inoculer 10 millilitres de liquide YEM moyen à partir d’une seule colonie de Mésorhizobium plurifarium BOR2, et incuber à 28 degrés Celsius pendant deux jours. Utilisez cette culture pour inoculer un plus grand volume de liquide YEM moyen. Une fois cultivée, centrifuger la culture bactérienne pendant 10 minutes à 3500 fois g pour récolter les cellules.
Suspendre à nouveau la pastille bactérienne dans le milieu liquide EKM et déterminer la densité optique. Préparez trois litres de medium EKM, ce qui est suffisant pour une vingtaine de pots, et inoculez-le avec la suspension rhizobiale. Mélanger le milieu avec 1,25 kilogramme de perlite et ajouter 210 grammes de ce mélange aux pots stériles de polypropylène translucide.
Plantez une à trois plantules parasponia andersonii à chaque pot, et préparez plusieurs pots avec des plantules transformées avec la construction de contrôle. Pesez plusieurs des pots et couvrez le fond de chaque pot pour protéger les racines de l’exposition à la lumière. Incubez les pots dans une salle de croissance climatisée à 28 degrés Celsius sous un régime de 16 heures par jour et huit heures de nuit pendant quatre à six semaines.
Une fois par semaine, peser plusieurs pots pour déterminer la perte d’eau. Si la perte d’eau dépasse 10 millilitres, compléter avec de l’eau ultra-pure pour compenser la perte. Après l’incubation, nettoyez les racines de la perlite et déterminez les nombres de nodules à l’aide d’une jumelle.
Cette technique a été utilisée pour transformer avec succès des pétioles et des segments de tiges Parasponia andersonii avec la souche Agrobacterium AGL1. Premièrement, les explantations tissulaires sont co-cultivées avec Agrobacterium pendant deux jours. La coculture prolongée entraîne une surcléc colonisation bactérienne et doit être évitée.
Quelques semaines plus tard, de petits micro-calli verts sont observés le long de la surface originale de la plaie. Ces calli continuent de croître et de développer une ou plusieurs pousses transformées de façon putative à six à huit semaines après le début de la transformation. L’efficacité de la transformation varie de 10 à 30 % pour les explantations tissulaires des branches matures à 65 à 75 % pour les explantations tissulaires provenant de branches jeunes et en croissance rapide.
Les pousses transgéniques peuvent être multipliées par la propagation in vitro, ce qui donne lieu à des dizaines de pousses en un mois. Ces pousses peuvent être placées sur le milieu d’enracinement qui induirea la formation de racines dans environ deux semaines et donnera des plantes qui peuvent être utilisées pour l’expérimentation. Lors du démarrage d’une expérience de transformation stable, il est important de sélectionner des branches saines comme matériau source.
Les lignées transgéniques Parasponia T0 se propagent in vitro. Par conséquent, il est essentiel de bien génotyper les lignes transgéniques Parasponia. L’établissement de Parasponia comme modèle expérimental permet une analyse comparative entre deux lignées de nodulating liées à distance, Parasponia et légumineuses.
Ceci pourrait identifier les réseaux génétiques préservés sous-jacents à la symbiose de rhizobium. Parasponia peut également être un modèle précieux pour étudier d’autres sujets de recherche tels que la formation du bois, le développement de fleurs bisexuelles, ou la biosynthèse des métabolites secondaires spécifiques aux Cannabacées.
