هذه الطريقة سوف تمكن الباحثين من تحديد الديناميات المبكرة للتصاق الخلوية ونشر الخلايا التي تعتمد على المرسى على المصفوفة خارج الخلية بروتين الليفي خلال الإجهاد التأ المؤسد. هذه التقنية متعددة الاستخدامات ويمكن تكييفها لفحص ديناميكيات الهيكل العظمي في ظل مجموعة واسعة من الظروف. وعلاوة على ذلك، يجري الحصول على البيانات وتحليلها باستخدام معدات مختبرية مشتركة وبرامجيات متاحة مجانا.
يمكن أن يوفر فهم آليات كيفية إرفاق الخلايا وانتشارها في ECM أثناء التعديلات في حالة الأكسدة الحمراء رؤية قيمة في حالات المرض العادي ، مثل السرطان النقيلي. يمكن استخدام هذه الطريقة لفحص انتشار الخلايا والالتصاق في ظل ظروف مختلفة لثقافة الخلية ، وخطوط الخلايا المعتمدة على المرسى ، و / oxidants للإجابة على مجموعة واسعة من الأسئلة البيولوجية. هناك العديد من الكواشف المطلوبة لتنفيذ هذه التقنية.
ولذلك، من الضروري أن يتم تقديم جميع الحلول مسبقا قبل البدء. في BSL-II شهادة غطاء محرك التدفق laminar المنصوص عليها في الأنسجة ثقافة 24-well لوحة. ضع غطاء زجاجي واحد في كل بئر.
تسمية لوحة وفقا للرقم 1B من بروتوكول النص. المقبل، ماصة 500 ميكرولترات من حل فيبرومينكين في كل بئر. الماصات الحل على كل غطاء عدة مرات لضمان طلاء حتى والغمر الكامل.
غطي الطبق بالغطاء. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة. ثم إزالة لوحة من الحاضنة وpirpirate حل fibronectin من الآبار.
اغسل الآبار ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولترات من 1X PBS لكل غسل. التعرق الغسيل النهائي من 1X PBS، وكتلة الآبار مع 500 ميكرولترات من 0.5٪ delipidated BSA في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة لا تقل عن 15 دقيقة. أولا، قبل الحارة الحلول اللازمة في حمام مائي في 37 درجة مئوية.
في غطاء تدفق الفينار المعتمد BSL-II ، ابدأ بطبق أحادي من خلايا REF52 في طبق 10 سنتيمتر مربع واغسل الخلايا مرتين بستة ملليلترات من PBS 1X دافئ. المصل تجويع الخلايا لمدة ساعة واحدة على الأقل في ستة ملليلتر من محلول BSA الدافئة delipidated. بعد ذلك ، قم بغسل الخلايا بستة ملليلترات من PBS 1X الدافئة.
التعرق برنامج تلفزيوني وإضافة 1.5 ملليلتر من الحارة 0.5٪ تريبسين-EDTA الحل. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة دقيقتين تقريبا. مراقبة الخلايا تحت مجهر الضوء لضمان أن الانفصال هو الكامل.
إذا كانت الخلايا لا تزال متمسكة بعد النقر على لوحة على مقاعد البدلاء، وإعادتها إلى الحاضنة لمدة دقيقتين إضافيتين. Pipette 1.5 ملليلتر من محلول تحييد التربسين الدافئ ، TNS ، إلى الطبق لوقف التبسينية وجمع الخلايا المنفصلة. الماصات الحل صعودا وهبوطا على الجزء السفلي من لوحة عدة مرات لإزالة جميع الخلايا المتبقية من أتباع.
إذا كانت الخلايا تبدو متكتلة، مزيد من triturate تعليق الخلية عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا على الجزء الخلفي من الطبق. بعد ذلك، عد الخلايا باستخدام استبعاد أزرق trypan في عداد الخلايا التلقائية. إزالة كمية مناسبة من الخلايا لإنشاء تعليق خلية مع كثافة الخلية بين 10, 000 و 30,000 خلية لكل ملليلتر في BSA delipidated في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر.
استخدم دواراً ثابت الزاوية في جهاز طرد مركزي من المنضدة للطرد المركزي للخلايا بمعدل 300 مرة ز لمدة خمس دقائق. التعرق و إعادة تعليق بيليه الخلية في سبعة ملليلتر من محلول BSA الدافئة. ثم تقسيم بالتساوي تعليق الخلية إلى اثنين من أنابيب مخروطية 15 ملليلتر، واحدة للسيطرة على السيارة وحدها، واحد لKu55933.
باستخدام دوار أنبوب، تدور الأنابيب لمدة 90 إلى 120 دقيقة في حاضنة ثقافة الخلية في 37 درجة مئوية. قبل 30 دقيقة من الطلاء، أضف Ku55933 وDDSO إلى كل أنبوب إلى تركيز نهائي من 10 ميكرومولار. إرجاع تعليق الخلية إلى المدورة للوقت المتبقي.
مباشرة قبل طلاء الخلايا، واسترداد لوحة من الحاضنة وpirpirate حل BSA delipidated. بعد ذلك، إزالة 500 ميكرولترات من تعليق الخلية من كل مجموعة العلاج وإضافة كل واحد إلى واحدة من زلات غطاء ليفي المغلفة في لوحة 24-جيدا. متابعة احتضان لوحة وتعليق الخلية في الظروف السابقة.
ثم تسمح للخلايا إلى التمسك غطاء لطول المطلوب من الوقت. بعد مرور الوقت المطلوب للتصاق، التعرق حل الخلية من كل غطاء في لوحة. الاستغناء بلطف 500 ميكرولترات من 3.7٪ حل paraformaldehyde على كل غطاء عن طريق الأنابيب أسفل جانبي الآبار، وانتظر 10 إلى 15 دقيقة.
المقبل، وإزالة حل paraformaldehyde وغسل كل غطاء مرتين مع 1X برنامج تلفزيوني باستخدام 500 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني لكل غسل. التعرق في برنامج تلفزيوني والخلايا permeabilized على كل غطاء مع 500 ميكرولترات من 0.2٪ تريتون X-100 و 1X PBS لمدة 10 إلى 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم غسل كل غطاء ثلاث مرات مع 1X PBS باستخدام 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لكل غسل.
كتلة الخلايا على كل غطاء مع 500 ميكرولترات من عازلة حجب المناعة لمدة 30 إلى 60 دقيقة. تمييع الأجسام المضادة الأولية المضادة paxillin في العازلة حظر بنسبة واحد إلى 250. تخلط جيدا وإضافة 200 ميكرولترات من حل الأجسام المضادة لكل غطاء.
احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة على الأقل. بعد ذلك، التعرق حل الأجسام المضادة وغسل كل غطاء مع 500 ميكرولترات من 1X PBS لمدة 10 دقائق. حماية العينات من الضوء من هذه النقطة إلى الأمام.
تمييع phalloidin F-actin التحقيق مترافق مع صبغة الفلورسنت الأحمر اليكسا 594 والماعز المضادة للماوس 488 الأجسام المضادة الثانوية الفلورية في نفس الحل العازلة حظر. تخلط جيدا وإضافة 200 ميكرولترات من حل الأجسام المضادة لكل غطاء لمدة 30 دقيقة. استلهم محلول الأجسام المضادة واغسل كل غطاء بـ 500 ميكرولترات من 1X PBS لمدة 10 دقائق.
استلهم برنامج تلفزيوني وشطف الغطاء ينزلق مرة واحدة مع 500 ميكرولترات من المياه ديونيد. ثم إصلاح الغطاء زلات على الشرائح المجهر باستخدام وسائل مكافحة تتلاشى تصاعد التي تحتوي على DAPI. بعد التثبيت والتلطيخ مع الأجسام المضادة paxillin المضادة، يتم الحصول على الصور الفلورية 8 بت الرمادي من خلايا REF52.
عند الانتهاء من جميع خطوات معالجة الصور ، ينبغي أن تكون الالتصاقات البؤرية الفردية بارزة ، في التركيز ، ويمكن تمييزها بسهولة عن بعضها البعض. ثم يتم أخذ صور الفلورس ذات تدرج الرمادي من المضادة paxillin وphalloidin F-actin الخلايا الملطخة التحقيق بعد أن مطلي على فيبرومينكتين. الالتصاقات المحورية البارزة وألياف الإجهاد يجب أن تكون مرئية بسهولة في خلايا REF52 بعد أن يسمح للتمسك في الليفي لمدة 20 إلى 30 دقيقة.
تتم الإشارة إلى الكشكشة المُثرية F-actin عند الحافة الرائدة لأغشية الخلايا بسهم. يتم تحليل صور مماثلة الفلورسنت من phalloidin F-actin التحقيق ومضادة للباكسيلين تلطيخ النسبة المئوية من ألياف الإجهاد في انتشار الخلايا. وتجدر الإشارة إلى أن العلاج المؤكد يسبب زيادة كبيرة في تكوين الألياف الإجهاد في جميع نقاط الوقت التصاق فحصها، وانخفاض في انتشار الخلايا بعد 15 دقيقة من التصاق الخلية إلى فيبرومينكتين.
يؤدي الطلاء بكثافة الخلايا الأعلى إلى الاكتظاظ الخلوي الذي يمنع الخلايا من الانتشار الكامل بسبب الإفراط في الوفرة. لاحظ أن حواف الخلية لا يمكن تمييزها عن الخلايا المجاورة. ونتيجة لذلك، يتم استبعاد تحديد كمية الخلايا الفردية ولا يمكن تحديد انتشار محيطها بدقة.
يتم تعليق خط خلية منفصل من الخلايا الليفية الجنينية الماوس ثم مطلية على الليفي لمدة 30 دقيقة. ثم تم إصلاح الخلايا وملطخة بآضاد مضاد للباكسيلين. لاحظ الخلايا خارج التركيز.
وعلاوة على ذلك، فإن التفاعل عبر الأجسام المضادة لباكسيلين المضادة مع الحطام الخلوية سوف يغير العتبة أثناء التحليل الكمي للصورة وينبغي عدم إدراجها في التحليل. أثناء معالجة الصور، استخدم أداة البحث في فيجي لفحص الرسم البياني للصورة مع ضبط السطوع/التباين لتجنب المزالق المرتبطة بتشبع الإشارة. قد تؤثر التغييرات في التصاق وانتشار الهجرة الخلية.
يمكن أن تحدد أساليب تتبع ترحيل الخلايا المفردة أو التئام الجروح أو مقايسات غزو chemotaxis ما إذا كانت التغييرات تحدث في الهجرة. Rho الأسرة GTPases تنظيم ديناميات التصاق الخلية من خلال تفعيلها المكانية المكانية المحددة. قد تكون التغيرات الظاهرية في التصاق وانتشار أثناء الإجهاد التأديدي موحية من الأدوار التنظيمية المصب لهذه البروتينات.
وتتطلب هذه الطريقة استخدام خطوط خلايا BSL-II والكواشف الكيميائية الخطرة. يحتاج الباحثون إلى تدريب على السلامة الكيميائية والبيولوجية على النحو الذي يحدده مكتب الصحة والسلامة البيئيين التابع لمؤسستهم.
