Bu yöntem, araştırmacıların oksidatif stres sırasında hücreli adezyon ve ankraja bağımlı hücrelerin ekstrasellüler matriks proteini fibronektin üzerine yayılmasının erken dinamiklerini ölçmelerini sağlayacaktır. Bu teknik çok yönlüdür ve sitoskelet dinamiklerini çok çeşitli koşullar altında incelemek için uyarlanabilir. Ayrıca, veri toplama ve analiz ortak laboratuvar ekipmanları ve serbest çesitli yazılımlar kullanılarak gerçekleştirilir.
Redoks durumundaki değişiklikler sırasında hücrelerin ECM'ye nasıl bağlanıp yayıldığına ilişkin mekanizmaların anlaşılması, metastatik kanser gibi normal ve hastalık durumlarına dair değerli bilgiler sağlayabilir. Bu yöntem, hücre yayılma ve yapışmafarklı hücre kültürü koşulları altında incelemek için kullanılabilir, ankraj bağımlı hücre hatları, ve / oksidanlar biyolojik soruların geniş bir yelpazede cevaplamak için. Bu tekniği gerçekleştirmek için gerekli çok sayıda reaktif vardır.
Bu nedenle, tüm çözümler başlamadan önce önceden yapılır esastır. Bir BSL-II sertifikalı laminar akış başlık bir doku kültürü sertifikalı 24-well plaka ortaya çıkardı. Her kuyuya bir cam kapak yerleştirin.
Plakayı metin protokolünün şekil 1B'sine göre etiketleyin. Sonra, pipet 500 mikrolitre fibronektin çözeltisi her kuyuya. Pipet, eşit bir kaplama ve tam bir daldırma sağlamak için her coverslip üzerinde çözelti birkaç kez.
Tabağı kapakla kapatın. Plakayı 37 derecede bir saat boyunca %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın. Daha sonra tabağı kuvözden çıkarın ve fibronektin çözeltisini kuyulardan aspire edin.
Kuyuları yıkama başına 500 mikrolitre 1X PBS kullanarak üç kez yıkayın. 1X PBS'nin son yıkamasını aspire edin ve %0,5'lik delipidated BSA çözeltisinin 500 mikrolitresini 37 santigrat derecede ve en az %5 karbondioksitle 15 dakika boyunca bloke edin. İlk olarak, 37 santigrat derecede bir su banyosunda gerekli çözümleri önceden ısıtın.
BSL-II sertifikalı laminar akış kaputunda, 10 santimetre karelik bir kapta REF52 hücrelerinin bir parçası olan bir monotabakası ile başlayın ve hücreleri altı mililitre sıcak 1X PBS ile iki kez yıkayın. Serum, altı mililitre sıcak delipidated BSA çözeltisinde hücreleri en az bir saat aç eder. Daha sonra, altı mililitre ısıtılmış 1X PBS ile hücreleri yıkayın.
PBS aspire ve sıcak 1.5 mililitre ekleyin 0.5%tripsin-EDTA çözeltisi. Hücreleri 37 derecede yaklaşık iki dakika boyunca %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın. Müfreze tamamlandığından emin olmak için hücreleri ışık mikroskobu altında gözlemleyin.
Hücreler tezgahın üstündeki tabağa dokunduktan sonra hala yapışıksa, iki dakika daha kuvöze geri verin. Pipet 1.5 mililitre sıcak tripsin nötralize çözeltisi, TNS, tripsinizasyon durdurmak ve müstakil hücreleri toplamak için çanak için. Pipet solüsyon yukarı ve aşağı plaka nın alt üzerinde birçok kez kalan yapışık hücrelerin tüm kaldırmak için.
Hücreler kümeli görünürse, yavaşça çanak arka üzerinde yukarı ve aşağı boru lama tarafından hücre süspansiyon üçe triturate. Ardından, otomatik bir hücre sayacında trypan mavisi hariç tutma kullanarak hücreleri sayın. 15 mililitrelik konik tüpte delipidate BSA mililitre başına 10, 000 ve 30, 000 hücre yoğunluğu ile bir hücre süspansiyon oluşturmak için hücrelerin uygun miktarda çıkarın.
Hücreleri 5 dakika boyunca 300 kez g'de santrifüj etmek için masa üstü santrifüjünde sabit açılı bir rotor kullanın. Supernatant aspire ve sıcak delipidated BSA çözeltisi yedi mililitre hücre pelet yeniden askıya. Sonra eşit iki 15 mililitrelik konik tüpler, araç tek başına kontrol için bir ve Ku55933 için bir hücre süspansiyon bölün.
Bir tüp rotator kullanarak, 37 santigrat derece bir hücre kültürü kuluçka tüpleri 90 ila 120 dakika tüpler döndürün. Kaplamadan 30 dakika önce, her tüpe 10 mikromolar son konsantrasyonuna Ku55933 ve DMSO ekleyin. Kalan süre boyunca hücre süspansiyonuna rotator'a geri dönün.
Hücreleri kaplamadan hemen önce, tabağı kuvözden alın ve delipidate BSA çözeltisine aspire edin. Bundan sonra, her tedavi grubundan hücre süspansiyonunun 500 mikrolitresini çıkarın ve her birini 24 kuyudaki fibronektin kaplı kapak fişlerine ekleyin. Önceki koşullarda plakayı ve hücre süspansiyonuna kuluçkaya yatın.
Daha sonra hücrelerin istenilen süre boyunca kapak kaymasına yapışmasını bekleyin. Yapışma için istenilen süre geçtikten sonra, plakadaki her kapak kaymasından hücre çözeltisini aspire edin. Kuyuların kenarlarını borulayarak her coverslip üzerine %3,7 paraformaldehit çözeltisi 500 mikrolitre verin ve 10 ila 15 dakika bekleyin.
Daha sonra, paraformaldehit çözeltisini çıkarın ve her coverslip'i yıkama başına 500 mikrolitre PBS kullanarak 1X PBS ile iki kez yıkayın. Oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika boyunca %0,2 Triton X-100 ve 1X PBS olmak üzere 500 mikrolitre ile her örtüdeki PBS ve permeabilize hücreleri aspire edin. Daha sonra her coverslip'i yıkama başına 500 mikrolitre PBS kullanarak 1X PBS ile üç kez yıkayın.
Her kapaktaki hücreleri 500 mikrolitre immünoresans bloke edici tampon ile 30 ila 60 dakika boyunca bloke edin. Bir-250 oranında bloke tampon birincil anti-paxillin antikor seyreltin. İyice karıştırın ve her coverslip antikor çözeltisi 200 mikrolitre ekleyin.
En az bir saat oda sıcaklığında kuluçka. Bundan sonra antikor çözeltisini aspire edin ve her coverslip'i 10 dakika boyunca 500 mikrolitre 1X PBS ile yıkayın. Örnekleri ışıktan bu noktadan koruyun.
Aynı engelleme tampon çözeltisi kırmızı floresan Alexa 594 boya ve keçi anti-fare 488 floresan ikincil antikor konjuge phalloidin F-actin probu seyreltin. İyice karıştırın ve 30 dakika boyunca her coverslip antikor çözeltisi 200 mikrolitre ekleyin. Antikor çözeltisini aspire edin ve her coverslip'i 10 dakika boyunca 500 mikrolitre 1X PBS ile yıkayın.
PBS aspire ve deiyonize su 500 mikrolitre ile bir kez kapak fişleri durulayın. Daha sonra kapak kaymalarını DAPI içeren anti-fade montaj ortamını kullanarak mikroskop slaytlarına sabitle. Bir anti-paxillin antikor ile fiksasyon ve boyama sonra, REF52 hücrelerinin floresan 8-bit gri tonlama görüntüleri elde edilir.
Tüm görüntü işleme adımlarının tamamlanmasından sonra, tek tek odak yapışıklığı belirgin, odakta ve birbirinden kolayca ayırt edilebilir olmalıdır. Anti-paxillin ve phalloidin F-aktin boyalı hücrelerin gri tonlama floresan görüntüleri daha sonra fibronektin üzerine kaplandıktan sonra alınır. Belirgin fokal yapışıklıklar ve stres lifleri 20-30 dakika fibronektin yapışmasına izin verildikten sonra REF52 hücrelerinde kolayca görülmelidir.
Hücre zarlarının ön kenarında f-aktin zenginleştirilmiş fırfırlar bir ok ile gösterilir. Phalloidin F-aktin probu ve anti-paxillin boyama benzer floresan görüntüleri hücre yayılımı stres liflerinin yüzdesi için analiz edilir. Özellikle oksidan tedavi, incelenen tüm yapışma zaman noktalarında stres lifi oluşumunda önemli bir artışa ve fibronektin'e 15 dakikalık hücre adezyonu sonrasında hücre yayılımında azalmaya neden olur.
Yüksek hücre yoğunluklarında kaplama, hücrelerin aşırı çakışma nedeniyle tam olarak yayılmasını yasaklayan hücresel kalabalığa yol açar. Hücre kenarlarının bitişik hücrelerden ayırt edilemez olduğuna dikkat edin. Sonuç olarak, tek tek hücrelerin sayısallaştırılması engellenir ve yayılan çevre doğru olarak belirlenemez.
Fare embriyonik fibroblastlar ayrı bir hücre hattı süspansiyon tutulur ve daha sonra fibronectin üzerinde 30 dakika kaplama. Hücreler daha sonra sabit ve bir anti-paxillin antikor ile lekeli edildi. Odak dışı hücrelere dikkat edin.
Ayrıca, anti-paxillin antikor hücresel enkaz ile çapraz reaktivitesi kantitatif görüntü analizi sırasında eşik değişecek ve analizdahil edilmemelidir. Görüntü işleme sırasında, sinyal doygunluğuyla ilgili tuzakları önlemek için parlaklığı/kontrastı ayarlarken görüntü histogramını incelemek için Fiji'deki arama aracını kullanın. Yapışma ve yayılmadaki değişiklikler hücre geçişini etkileyebilir.
Tek hücre göçlerini, yara iyileşmesini veya kemotaksit invazyonunu izleme yöntemleri göçte değişiklik olup olmadığını belirleyebilir. Rho ailesi GTPases, hücre yapışma dinamiklerini spesifik mekansal zamansal aktivasyonları ile düzenler. Oksidatif stres sırasında yapveyon ve yayılmada fenotik değişiklikler bu proteinler için aşağı düzenleyici rolleri düşündürebilir.
Bu yöntem BSL-II hücre hatları nın ve tehlikeli kimyasal reaktiflerin kullanılmasını gerektirir. Araştırmacılar, kurumlarının çevre sağlığı ve güvenliği ofisi tarafından belirlenen kimyasal ve biyolojik güvenlik eğitimine ihtiyaç duyarlar.
