이 방법은 연구원이 산화 스트레스 도중 세포 외 매트릭스 단백질 섬유네신에 세포 접착 및 앵커리지 의존성 세포의 초기 역학을 정량화할 수 있게 합니다. 이 기술은 다재다능하며 광범위한 조건에서 사이토스켈레탈 역학을 검사하도록 조정할 수 있습니다. 또한 공통 실험실 장비와 자유롭게 사용할 수 있는 소프트웨어를 사용하여 데이터 수집 및 분석을 수행합니다.
세포가 백변성 상태의 변경 중에 ECM에 부착하고 퍼지는 방법에 대한 메커니즘을 이해하면 전이성 암과 같은 정상 및 질병 상태에 대한 귀중한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이 방법은 상이한 세포 배양 조건, 앵커리지 의존세포주 및/산화제 하에서 세포 확산 및 접착력을 검사하여 광범위한 생물학적 질문에 답하는 데 사용할 수 있다. 이 기술을 수행하는 데 필요한 수많은 시약이 있습니다.
따라서 모든 솔루션이 시작하기 전에 사전에 만들어지는 것이 필수적입니다. BSL-II 인증 라미나르 플로우 후드에서 조직 배양 인증 24웰 플레이트를 설정. 유리 커버슬립 1개를 각 웰에 넣습니다.
텍스트 프로토콜의 그림 1B에 따라 플레이트에 레이블을 지정합니다. 다음으로, 각 우물에 섬유네틴 용액의 파이펫 500 마이크로리터. 각 커버 위에 용액을 피펫하면 균일한 코팅과 완전한 침수를 보장하기 위해 몇 번 미끄러짐.
뚜껑으로 접시를 덮습니다. 1시간 동안 이산화탄소 5%를 37도에서 배양합니다. 그런 다음 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 우물에서 섬유네틴 용액을 흡인시합니다.
세척당 1X PBS 500 마이크로리터를 사용하여 우물을 세 번 씻으시면 됩니다. 1X PBS의 최종 세척을 흡수하고, 최소 15분 동안 5%의 이산화탄소를 37도에서 0.5%의 BSA 용액500마이크로리터로 차단합니다. 먼저, 섭씨 37도에서 수조에 필요한 솔루션을 미리 데워보겠습니다.
BSL-II 인증 라미나르 플로우 후드에서 REF52 세포의 컨물루블 한 단층으로 시작하여 10 평방 센티미터 의 접시에 담아 따뜻한 1X PBS6 밀리리터로 셀을 두 번 씻으시다. 세럼은 따뜻한 디리피들 BSA 용액의 6 밀리리터에서 적어도 한 시간 동안 세포를 굶어 버티고 있습니다. 다음으로, 따뜻하게 1X PBS의 6 밀리리터로 세포를 씻는다.
PBS를 흡인하고 따뜻한 0.5 % 트립신 -EDTA 솔루션의 1.5 밀리리터를 추가합니다. 약 2 분 동안 5 %의 이산화탄소와 섭씨 37도에서 세포를 배양. 분리가 완료되었는지 확인하기 위해 가벼운 현미경으로 세포를 관찰하십시오.
벤치 상단의 플레이트를 탭한 후에도 셀이 여전히 부착되어 있는 경우 추가로 2분 동안 인큐베이터로 되돌보아 보입니다. 피펫 1.5 밀리리터의 따뜻한 트립신 중화 용액, TNS, 접시에 트립시화를 중지하고 분리 된 세포를 수집합니다. 파이펫은 나머지 부착 셀을 모두 제거하기 위해 플레이트 의 바닥을 위아래로 여러 번 피펫합니다.
세포가 덩어리로 나타나면 접시 뒤쪽을 위아래로 부드럽게 피펫하여 셀 현탁액을 세타게 합니다. 다음으로, 자동화된 셀 카운터에서 trypan 파란색 제외를 사용하여 셀을 계산합니다. 15밀리리터 원칼 튜브에서 10, 000 및 30, 밀리리터 당 000 세포 사이의 세포 밀도를 가진 세포 현탁액을 생성하기 위해 적절한 양의 세포를 제거합니다.
탁상 원심분리기의 고정 각도 로터를 사용하여 5분 동안 300배 g의 원심분리기를 사용합니다. 슈퍼나탈아를 흡인시키고 따뜻한 BSA 용액의 7밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 중단한다. 그런 다음 셀 서스펜션을 차량 단독 제어를 위한 15밀리리터 원뿔튜브 2개와 Ku55933용 튜브로 균등하게 분할합니다.
튜브 회전기를 사용하여 37°C의 세포 배양 인큐베이터에서 90~120분 동안 튜브를 회전합니다. 도금 30분 전에 각 튜브에 Ku55933 및 DMSO를 추가하여 10 마이크로몰러의 최종 농도를 유지합니다. 남은 시간 동안 셀 서스펜션을 회전기로 반환합니다.
세포를 도금하기 직전에 인큐베이터에서 플레이트를 회수하고 탈면된 BSA 용액을 흡인시합니다. 그 후, 각 치료군으로부터 세포 현탁액의 500마이크로리터를 제거하고 24웰 플레이트내의 섬유네틴 코팅 커버 슬립 중 하나에 각각을 추가한다. 이전 조건에서 플레이트및 셀 서스펜션을 계속 배양합니다.
그런 다음 셀이 원하는 시간 동안 커버 슬립을 부착할 수 있도록 합니다. 접착에 대한 원하는 시간이 경과한 후, 플레이트내의 각 커버슬립으로부터 셀 용액을 흡인한다. 웰의 측면을 피펫하여 각 커버슬립에 3.7%의 파라포름알데히드 용액500마이크로리터를 부드럽게 분배하고 10~15분 간 기다립니다.
다음으로, 파라포름알데히드 용액을 제거하고 세척당 PBS 500 마이크로리터를 사용하여 1X PBS로 각 커버슬립을 두 번 세척합니다. 실온에서 10~15분 동안 0.2%트리톤 X-100 및 1X PBS의 500마이크로리터로 각 커버슬립에 PBS 및 투과셀을 흡인한다. 그런 다음 세척당 PBS 500 마이크로리터를 사용하여 1X PBS로 각 커버슬립을 세 번 세척합니다.
면역 형광 차단 버퍼의 500 마이크로 리터와 각 커버 슬립에 세포를 차단 30 받는 일 60 분. 1-250의 비율로 차단 완충제에서 1차 항 팍실린 항체를 희석한다. 잘 섞어서 각 커버슬립에 항체 용액의 200 마이크로리터를 추가합니다.
실온에서 적어도 한 시간 동안 배양하십시오. 그 후, 항체 용액을 흡인시키고 각 커버슬립을 1X PBS 500 마이크로리터로 10분 동안 세척한다. 이 시점부터 앞으로 샘플을 보호합니다.
동일한 차단 버퍼 용액에서 적색 형광 알렉사 594 염료 및 염소 항마우스 488 형광 이차 항체에 컨쥬게이징된 phalloidin F-actin 프로브를 희석시. 잘 섞고 항체 용액200마이크로리터를 각 커버슬립에 30분간 추가합니다. 항체 용액을 흡인시키고 각 커버슬립을 1X PBS 500마이크로리터로 10분간 세척합니다.
PBS를 흡인하고 500 마이크로리터의 산화된 물로 커버 슬립을 헹구세요. 그런 다음 DAPI를 함유한 페이드 장착 방지 배지를 사용하여 커버 슬립을 현미경 슬라이드에 고정합니다. 항 팍실린 항체로 고정 및 염색 후, REF52 세포의 형광 8 비트 그레이스케일 이미지가 획득된다.
모든 이미지 처리 단계가 완료되면 개별 초점 접착력이 두드러지고 초점이 맞추어져 서로 쉽게 구별되어야 합니다. 항 팍실린과 프할로이진 F-액틴 프로브 스테인드 셀의 그레이스케일 형광 이미지는 섬유네틴에 도금된 후 촬영됩니다. 눈에 띄는 초점 접착및 응력 섬유는 20-30 분 동안 섬유 네틴을 부착 할 수 있게 된 후 REF52 세포에서 쉽게 볼 수 있어야합니다.
세포막의 앞가장자리에서 F-actin 농축 주름은 화살표로 표시됩니다. phalloidin F-actin 프로브 및 안티 팍실린 염색의 유사한 형광 심상은 세포 확산에 있는 응력 섬유의 백분율을 위해 분석됩니다. 특히, 산화 치료는 검사된 모든 접착 시간 지점에서 스트레스 섬유 형성이 현저히 증가하고, 섬유네틴에 대한 세포 접착15분 이후에 세포 확산이 감소합니다.
더 높은 세포 밀도에서 도금은 과응성 때문에 완전히 퍼지는 세포를 금지하는 세포 혼잡으로 이끌어 냅니다. 셀 모서리는 인접한 셀과 구별할 수 없습니다. 그 결과, 개별 세포의 정량화가 배제되고 둘레확산을 정확하게 결정할 수 없다.
마우스 배아 섬유아세포의 별도의 세포주현탁액은 현탁액으로 유지된 다음 30분 동안 섬유네틴에 도금된다. 세포는 그 때 항 paxillin 항체로 고정되고 얼룩졌습니다. 초점이 맞고 셀에 유의하십시오.
더욱이, 세포이파편을 가진 항팍실린 항체의 상호 반응성은 정량적 이미지 분석 중에 임계값을 변경하고 분석에 포함되어서는 안 된다. 이미지 처리 중에 피지의 조회 도구를 사용하여 이미지 히스토그램을 검사하면서 신호 포화와 관련된 함정을 피하기 위해 밝기 /대비를 조정합니다. 접착 및 확산의 변화는 세포 이동에 영향을 미칠 수 있습니다.
단일 세포 마이그레이션, 상처 치유 또는 화학 요법 침입 검사를 추적하는 방법은 마이그레이션의 변경이 발생하는지 확인할 수 있습니다. Rho 제품군 GTPases는 특정 공간 측두활성화를 통해 세포 접착 역학을 조절합니다. 산화 스트레스 중 접착 및 확산에 있는 Phenotypic 변경은 이 단백질을 위한 다운스트림 규제 역할의 암시일 수 있습니다.
이 방법은 BSL-II 세포주 및 유해 화학 시약의 사용을 필요로한다. 연구원은 그들의 기관의 환경 건강 및 안전 사무실에 의해 결정된 화학 및 생물학 안전 훈련을 요구합니다.
