Este método permitirá a los investigadores cuantificar la dinámica temprana de la adhesión celular y la propagación de células dependientes del anclaje en la fibronectina de la matriz extracelular durante el estrés oxidativo. Esta técnica es versátil y se puede adaptar para examinar la dinámica citoesquelética en una amplia gama de condiciones. Además, la adquisición y el análisis de datos se realizan utilizando equipos de laboratorio comunes y software de libre disposición.
Comprender los mecanismos de cómo las células se unen y se propagan en el ECM durante las alteraciones en el estado de redox puede proporcionar información valiosa sobre los estados normales y de la enfermedad, como el cáncer metastásico. Este método se puede utilizar para examinar la propagación y adhesión celular en diferentes condiciones de cultivo celular, líneas celulares dependientes del anclaje y/oxidantes para responder a una amplia gama de preguntas biológicas. Hay numerosos reactivos necesarios para realizar esta técnica.
Por lo tanto, es esencial que todas las soluciones se hagan con antelación antes de comenzar. En una capucha de flujo laminar certificada BSL-II estableció una placa de 24 pozos certificada por cultivo de tejido. Coloque un cubreobjetos de vidrio en cada pozo.
Etiquete la placa según la figura 1B del protocolo de texto. A continuación, pipetear 500 microlitros de la solución de fibronectina en cada pozo. Pipetear la solución sobre cada cubierta varias veces para asegurar un recubrimiento uniforme y una inmersión completa.
Cubra la placa con la tapa. Incubar la placa a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante una hora. A continuación, retire la placa de la incubadora y aspire la solución de fibronectina de los pozos.
Lave los pozos tres veces con 500 microlitros de 1X PBS por lavado. Aspirar el lavado final de 1X PBS, y bloquear pozos con 500 microlitros de una solución BSA deslipidada al 0,5% a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante un mínimo de 15 minutos. En primer lugar, precalentó las soluciones necesarias en un baño de agua a 37 grados centígrados.
En una campana de flujo laminar con certificación BSL-II, comience con una monocapa confluente de células REF52 en un plato de 10 centímetros cuadrados y lave las células dos veces con seis mililitros de pbS caliente de 1X. Suero muere de hambre a las células durante al menos una hora en seis mililitros de solución de BSA deslipidada en caliente. A continuación, lave las células con seis mililitros de 1X PBS calentado.
Aspirar el PBS y añadir 1,5 mililitros de solución cálida de 0,5% de trippsina-EDTA. Incubar las células a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente dos minutos. Observe las células bajo un microscopio de luz para asegurarse de que el desprendimiento está completo.
Si las células siguen siendo adherentes después de tocar la placa en la parte superior del banco, devuélvalas a la incubadora durante dos minutos adicionales. Pipetear 1,5 mililitros de solución neutralizante de trippsina caliente, TNS, a la antena para detener la trippsina y recoger células separadas. Pipetear la solución hacia arriba y hacia abajo sobre la parte inferior de la placa varias veces para eliminar todas las células adherentes restantes.
Si las células parecen grumosas, tritura aún más la suspensión celular pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo sobre la parte posterior del plato. A continuación, cuente las celdas mediante la exclusión azul trypan en un contador de celdas automatizado. Retire una cantidad adecuada de células para crear una suspensión celular con la densidad celular entre 10,000 y 30,000 células por mililitro en BSA deslipidida en un tubo cónico de 15 mililitros.
Utilice un rotor de ángulo fijo en una centrífuga de mesa para centrifugar las células a 300 veces g durante cinco minutos. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet celular en siete mililitros de solución de BSA deslipidada en caliente. Luego divida uniformemente la suspensión celular en dos tubos cónicos de 15 mililitros, uno para el control solo del vehículo y otro para Ku55933.
Usando un rotador de tubo, gire los tubos durante 90 a 120 minutos en una incubadora de cultivo celular a 37 grados Celsius. 30 minutos antes del encote, añadir Ku55933 y DMSO a cada tubo a una concentración final de 10 micromolares. Devuelva la suspensión celular al rotador durante el tiempo restante.
Inmediatamente antes de encoar las células, recupere la placa de la incubadora y aspire la solución de BSA deslipidada. Después de esto, retire 500 microlitros de la suspensión celular de cada grupo de tratamiento y agregue cada uno a uno de los resbalones de cubierta recubiertos de fibronectina en la placa de 24 pozos. Continúe incubando la placa y la suspensión celular en las condiciones anteriores.
Luego permita que las células se adhieran al cubreobjetos durante el período de tiempo deseado. Después de que haya pasado el tiempo deseado para la adhesión, aspire la solución celular de cada cubreobjetos en la placa. Dispensar suavemente 500 microlitros de 3.7%solución de paraformaldehído en cada tapaptable pipeteando por los lados de los pozos, y esperar de 10 a 15 minutos.
A continuación, retire la solución de paraformaldehído y lave cada cubreobjetos dos veces con 1 PBS utilizando 500 microlitros de PBS por lavado. Aspirar el PBS y las células permeabilizadas en cada cubrelip con 500 microlitros de 0.2%Triton X-100 y 1X PBS durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, lave cada cubreobjetos tres veces con 1X PBS utilizando 500 microlitros de PBS por lavado.
Bloquee las células de cada cubreobjetos con 500 microlitros de tampón de bloqueo de inmunofluorescencia durante 30 a 60 minutos. Diluir el anticuerpo anti paxillina primario en el tampón de bloqueo en una proporción de uno a 250. Mezclar bien y añadir 200 microlitros de la solución de anticuerpos a cada cubrelip.
Incubar a temperatura ambiente durante al menos una hora. Después de esto, aspirar la solución de anticuerpos y lavar cada cubreobjetos con 500 microlitros de 1X PBS durante 10 minutos. Proteja las muestras de la luz desde este punto hacia adelante.
Diluir la sonda F-actina de faloide conjugada con el tinte fluorescente rojo Alexa 594 y el anticuerpo secundario fluorescente antiratón 488 de cabra en la misma solución tampón de bloqueo. Mezclar bien y añadir 200 microlitros de la solución de anticuerpos a cada cubrepleta durante 30 minutos. Aspirar la solución de anticuerpos y lavar cada cubreobjetos con 500 microlitros de 1X PBS durante 10 minutos.
Aspirar el PBS y enjuagar los resbalones de la cubierta una vez con 500 microlitros de agua desionizada. A continuación, fije los resbalones de la cubierta en las diapositivas del microscopio utilizando un medio de montaje anti-fade que contiene DAPI. Después de la fijación y tinción con un anticuerpo anti-paxillina, se adquieren imágenes fluorescentes en escala de grises de 8 bits de las células REF52.
Al completar todos los pasos de procesamiento de imágenes, las adherencias focales individuales deben ser prominentes, enfocadas y fácilmente distinguibles entre sí. A continuación, se toman imágenes de fluorescencia en escala de grises de células manchadas de sonda F-actina anti-paxilina y falhalloidina después de ser chapadas en fibronectina. Las adherencias focales prominentes y las fibras de tensión deben ser fácilmente visibles en las células REF52 después de que se le permita adherirse a la fibronectina durante 20 a 30 minutos.
Los volantes enriquecidos con F-actina en el borde delantero de las membranas celulares se indican con una flecha. Se analizan imágenes fluorescentes similares de la sonda F-actina de falhallina y la tinción de anti-paxillina para detectar el porcentaje de fibras de tensión en la propagación celular. En particular, el tratamiento con oxidantes provoca un aumento significativo en la formación de fibra de estrés en todos los puntos de tiempo de adhesión examinados, y una disminución en la propagación celular después de 15 minutos de adhesión celular a la fibronectina.
El revestimiento a densidades celulares más altas conduce a la aglomeración celular que prohíbe que las células se propaguen completamente debido a la sobreconfluencia. Observe que los bordes de las celdas son indistinguibles de las celdas adyacentes. Como resultado, se excluye la cuantificación de células individuales y no se puede determinar con precisión la circunferencia de propagación.
Una línea celular separada de fibroblastos embrionarios de ratón se mantiene en suspensión y luego se ensilla sobre fibronectina durante 30 minutos. Las células se fijaron y teñiron con un anticuerpo anti-paxillina. Observe las celdas desenfocadas.
Además, la reactividad cruzada del anticuerpo anti paxillin con desechos celulares alterará el umbral durante el análisis cuantitativo de la imagen y no debe incluirse en el análisis. Durante el procesamiento de imágenes, utilice la herramienta de búsqueda en Fiji para examinar el histograma de la imagen mientras ajusta el brillo/contraste para evitar escollos relacionados con la saturación de la señal. Los cambios en la adhesión y la propagación pueden influir en la migración celular.
Los métodos para rastrear la migración de una sola célula, la cicatrización de heridas o los ensayos de invasión de quimiotaxis pueden determinar si se están produciendo alteraciones en la migración. Los GTPas de la familia Rho regulan la dinámica de adhesión celular a través de su activación temporal espacial específica. Los cambios fenotípicos en la adhesión y propagación durante el estrés oxidativo pueden sugerir roles reguladores posteriores para estas proteínas.
Este método requiere el uso de líneas celulares BSL-II y reactivos químicos peligrosos. Los investigadores requieren capacitación en seguridad química y biológica según lo determinado por la oficina de salud y seguridad ambiental de su institución.
