Diese Methode wird es den Forschern ermöglichen, die frühe Dynamik der zellulären Adhäsion und Der Ausbreitung von verankerungsabhängigen Zellen auf das extrazelluläre Matrixprotein Fibronectin während des oxidativen Stresses zu quantifizieren. Diese Technik ist vielseitig und kann angepasst werden, um die Zytoskelettdynamik unter einer Vielzahl von Bedingungen zu untersuchen. Darüber hinaus werden Datenerfassung und -analyse mit gängigen Laborgeräten und frei verfügbarer Software durchgeführt.
Das Verständnis der Mechanismen, wie Zellen sich während Veränderungen des Redoxstatus am ECM anheften und verbreiten, kann wertvolle Einblicke in Normal- und Krankheitszustände wie metastasierenden Krebs bieten. Diese Methode kann verwendet werden, um zellausbreitung und Adhäsion unter verschiedenen Zellkulturbedingungen, ankerabhängigen Zelllinien und/oxidanten zu untersuchen, um eine breite Palette von biologischen Fragen zu beantworten. Für diese Technik sind zahlreiche Reagenzien erforderlich.
Daher ist es wichtig, dass alle Lösungen vor Beginn im Voraus getroffen werden. In einer BSL-II zertifizierten laminaren Durchflusshaube wurde eine gewebekulturzertifizierte 24-Well-Platte aufgestellt. Legen Sie einen Glasdeckel in jeden Brunnen.
Beschriften Sie die Platte gemäß Abbildung 1B des Textprotokolls. Als nächstes Pipette 500 Mikroliter der Fibronectin-Lösung in jedem Brunnen. Pipette die Lösung über jede Abdeckungrutschen ein paar Mal, um eine gleichmäßige Beschichtung und vollständige Serbe zu gewährleisten.
Bedecken Sie die Platte mit dem Deckel. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für eine Stunde. Dann entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und aspirieren Sie die Fibronectin-Lösung aus den Brunnen.
Waschen Sie die Brunnen dreimal mit 500 Mikroliter 1X PBS pro Wäsche. Aspirieren Sie die Endwäsche von 1X PBS, und blockieren Sie Brunnen mit 500 Mikrolitereiner einer 0,5% ablipidierten BSA-Lösung bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für mindestens 15 Minuten. Zuerst die benötigten Lösungen in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius vorwärmen.
In einer BSL-II-zertifizierten laminaren Durchflusshaube beginnen Sie mit einer konfluenten Monoschicht von REF52-Zellen in einer 10-Quadrat-Zentimeter-Schale und waschen Sie die Zellen zweimal mit sechs Millilitern warmer 1X PBS. Serum verhungern die Zellen für mindestens eine Stunde in sechs Milliliter warm ablipidierter BSA-Lösung. Als nächstes waschen Sie die Zellen mit sechs Millilitern erwärmten 1X PBS.
Aspirieren Sie die PBS und fügen Sie 1,5 Milliliter warme 0,5%trypsin-EDTA Lösung. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für etwa zwei Minuten. Beobachten Sie die Zellen unter einem Lichtmikroskop, um sicherzustellen, dass die Ablösung abgeschlossen ist.
Wenn die Zellen nach dem Tippen auf die Platte auf der Bankplatte noch haften, geben Sie sie für weitere zwei Minuten an den Inkubator zurück. Pipette 1,5 Milliliter warme Trypsin-Neutralisationslösung, TNS, auf die Schale, um die Trypsinisierung zu stoppen und freistehende Zellen zu sammeln. Pipette die Lösung nach oben und unten über den Boden der Platte mehrmals, um alle verbleibenden haftenden Zellen zu entfernen.
Wenn die Zellen klumpig erscheinen, trituieren Sie die Zellsuspension weiter, indem Sie sanft über der Rückseite der Schale nach oben und unten pfeifen. Zählen Sie als Nächstes die Zellen mit Trypan-Blau-Ausschluss in einem automatisierten Zellenzähler. Entfernen Sie eine geeignete Menge an Zellen, um eine Zellsuspension mit einer Zelldichte zwischen 10.000 und 30 000 Zellen pro Milliliter in delipidiertem BSA in einer 15-Milliliter-Konikonröhre zu erstellen.
Verwenden Sie einen Festwinkelrotor in einer Tischzentrifuge, um die Zellen fünf Minuten lang mit 300 mal g zu zentrieren. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet in sieben Milliliterwarm-delipidierter BSA-Lösung wieder auf. Dann teilen Sie die Zellaufhängung gleichmäßig in zwei 15-Milliliter-Konusröhren auf, eine für die Fahrzeug-allein-Steuerung und eine für Ku55933.
Mit einem Rohrrotator drehen Sie die Rohre 90 bis 120 Minuten in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius. 30 Minuten vor der Beschichtung Ku55933 und DMSO zu jeder Röhre zu einer Endkonzentration von 10 Mikromolaren hinzufügen. Geben Sie die Zellsuspension für die verbleibende Zeit an den Rotator zurück.
Unmittelbar vor der Beschichtung der Zellen, holen Sie die Platte aus dem Inkubator und aspirieren Sie die delipidierte BSA-Lösung. Danach 500 Mikroliter der Zellsuspension aus jeder Behandlungsgruppe entfernen und jeweils zu einem der fibronectinbeschichteten Abdeckungsscheine in der 24-Well-Platte hinzufügen. Setzen Sie die Inkubation der Platte und der Zellsuspension unter den vorherigen Bedingungen fort.
Dann lassen Sie die Zellen auf dem Deckschein für die gewünschte Länge der Zeit haften. Nachdem die gewünschte Haftzeit verstrichen ist, die Zelllösung aus jedem Deckelinrutsch in der Platte aspirieren. 500 Mikroliter 3,7% Paraformaldehydlösung vorsichtig auf jeden Deckelschlupf geben, indem Sie die Seiten der Brunnen herunterpfeifen, und 10 bis 15 Minuten warten.
Als nächstes entfernen Sie die Paraformaldehydlösung und waschen Sie jeden Deckelrutsch zweimal mit 1X PBS mit 500 Mikroliter PBS pro Wäsche. Aspirieren Sie die PBS und permeabilisierten Zellen auf jedem Deckelrutsch mit 500 Mikroliter 0,2%Triton X-100 und 1X PBS für 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur. Dann waschen Sie jeden Deckelrutsch dreimal mit 1X PBS mit 500 Mikroliter PBS pro Wäsche.
Blockieren Sie die Zellen auf jedem Coverslip mit 500 Mikroliter Immunfluoreszenz-Blockierungspuffer für 30 bis 60 Minuten. Verdünnen Sie den primären Anti-Paxillin-Antikörper im Blockierpuffer im Verhältnis eins zu 250. Mischen Sie gut und fügen Sie 200 Mikroliter der Antikörperlösung zu jedem Coverslip hinzu.
Bei Raumtemperatur mindestens eine Stunde inkubieren. Danach die Antikörperlösung ansaugen und jeden Deckelrutsch mit 500 Mikroliter1X PBS 10 Minuten waschen. Schützen Sie die Proben von diesem Punkt aus vor Licht.
Verdünnen Sie die Phalloidin F-Actin Sonde, die mit dem roten fluoreszierenden Alexa 594 Farbstoff und dem Ziegenanti-Maus-Sekundärantikörper 488 konjugiert ist, in derselben Blockierpufferlösung. Mischen Sie gut und fügen Sie 200 Mikroliter der Antikörperlösung zu jedem Coverslip für 30 Minuten hinzu. Die Antikörperlösung ansaugen und jeden Deckelschlupf mit 500 Mikroliter1X PBS 10 Minuten waschen.
Das PBS ansaugen und die Abdeckung einmal mit 500 Mikroliter entionisiertem Wasser abspülen. Befestigen Sie dann die Abdeckungsrutschen auf Mikroskopschlitten mit Anti-Fade-Montagemedium, das DAPI enthält. Nach der Fixierung und Färbung mit einem Anti-Paxillin-Antikörper werden fluoreszierende 8-Bit-Graustufenbilder der REF52-Zellen erfasst.
Nach Abschluss aller Bildverarbeitungsschritte sollten einzelne Fokusverklebungen prominent, im Fokus stehen und leicht voneinander zu unterscheiden sein. Graustufenfluoreszenzbilder von Anti-Paxillin und Phalloidin F-Actin-Sonde gefärbten Zellen werden dann nach der Plattiert auf Fibronectin genommen. Prominente Fokaladesionen und Stressfasern sollten in REF52-Zellen gut sichtbar sein, nachdem sie 20 bis 30 Minuten an Fibronectin haften dürfen.
F-Actin angereicherte Rüschen an der Vorderkante der Zellmembranen sind mit einem Pfeil angezeigt. Ähnliche fluoreszierende Bilder von Phalloidin F-Actin-Sonde und Anti-Paxillin-Färbung werden für den Prozentsatz der Stressfasern bei der Zellausbreitung analysiert. Insbesondere verursacht die oxidationsmittelbehandelte Behandlung eine signifikante Zunahme der Stressfaserbildung an allen untersuchten Haftzeitpunkten und eine Abnahme der Zellausbreitung nach 15 Minuten Zelladhäsion zu Fibronectin.
Die Beschichtung bei höheren Zelldichten führt zu zellulärer Überfüllung, die eine vollständige Ausbreitung der Zellen aufgrund der Überkonfluenz verbietet. Beachten Sie, dass die Zellkanten nicht von benachbarten Zellen zu unterscheiden sind. Dadurch ist die Quantifizierung einzelner Zellen ausgeschlossen und die Verteilung des Umfangs kann nicht genau bestimmt werden.
Eine separate Zelllinie von mausembryonalen Fibroblasten werden in Suspension gehalten und dann 30 Minuten lang auf Fibronectin plattiert. Die Zellen wurden dann fixiert und mit einem Anti-Paxillin-Antikörper gefärbt. Beachten Sie die nicht fokussierten Zellen.
Darüber hinaus wird die Kreuzreaktivität des Anti-Paxillin-Antikörpers mit zellulären Ablagerungen die Schwellen während der quantitativen Bildanalyse verändern und sollte nicht in die Analyse einbezogen werden. Verwenden Sie während der Bildverarbeitung das Suchwerkzeug in Fidschi, um das Bildhistogramm zu untersuchen und gleichzeitig die Helligkeit/den Kontrast anzupassen, um Fallstricke im Zusammenhang mit der Signalsättigung zu vermeiden. Änderungen der Haftung und Verbreitung können die Zellmigration beeinflussen.
Methoden zur Verfolgung von Einzelzellmigration, Wundheilung oder Chemotaxis-Invasionstests können bestimmen, ob Veränderungen in der Migration auftreten. Rho Familie GTPases regulieren zelladisionendynamik durch ihre spezifische räumliche zeitliche Aktivierung. Phänotypische Veränderungen der Haftung und Ausbreitung während des oxidativen Stresses können auf nachgelagerte regulatorische Rollen für diese Proteine hindeuten.
Diese Methode erfordert die Verwendung von BSL-II-Zelllinien und gefährlichen chemischen Reagenzien. Die Forscher benötigen eine Schulung zur chemischen und biologischen Sicherheit, die vom Umweltamt für Umweltsicherheit ihrer Institution festgelegt wird.
