هذا البروتوكول له تأثير كبير في مجال اكتشاف المخدرات والتنمية، وخاصة في تطوير الأدوية الجديدة، الأولى في الدرجة الأولى مع الحد الأدنى من الآثار الجانبية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تطبيقها على أي نظام GPCR ، واستخدامها للحصول على معلومات دقيقة حول علم الصيدلة المستقبلات في أنظمة المعيشة في الوقت الحقيقي. الآثار المترتبة على هذه التقنية ترتبط ارتباطا وثيقا العلاجات الجديدة وخاصة عندما بيتا arrestins ذات الصلة.
وتشمل هذه مستقبلات opiod في الألم ومستقبلات الدوبامين في الفصام. يمكن أن تكون هذه الطريقة مفيدة في العديد من مجالات البحث العلمي الطبي من علم الأعصاب إلى أمراض القلب والرمون. PCR مظاهرة من طريقتنا مهم، لأنه يسمح لتقديم عرض مفصل للخطوات الحاسمة في البروتوكول، والتي لن تكون ممكنة مع النشر التقليدي.
تبدأ بتصميم التمهيدي لإدخال الجينات التي تهم ناقلات pBiT. نظرا لوقف codon inframe يقسم موقع الاستنساخ المتعدد ، حدد واحدا على الأقل من ثلاثة مواقع باعتبارها واحدة من اثنين من الإنزيمات تقييد فريدة من نوعها اللازمة للاستنساخ الاتجاهي. راجع المخطوطة للحصول على تسلسلات النيوكليوتيدات لترميز بقايا الرابط ودمجها في ال التمهيديات.
لpBiT1.1-C وpBiT2.1-C تأكد من أن التمهيدي إلى الأمام يحتوي على كودون ATG وتسلسل إجماع كوزاك قوية. لpBiT1.1-N وpBiT2.1-N تأكد من أن التمهيدي العكسي يحتوي على كودون وقف. استخدام التمهيديات المصممة لتضخيم الحمض النووي إدراج جين الفائدة.
الجمع بين الكواشف PCR وفقا لتوجيهات المخطوطات، مع التأكد من استخدام البوليميراز DNA عالية الدقة لتقليل الطفرات. برنامج الحرارية والبدء في رد الفعل. بعد الانتهاء من PCR، هضم المنتج في رد فعل الهضم 50 ميكرولتر.
في أنبوب 1.5 ملليلتر، والجمع بين 12 ميكرولترات من الماء المقطر، وخمسة ميكرولترات من المناسبة 10X تقييد الهضم العازلة، و 30 ميكرولترات من المنتج PCR. ثم إضافة 1.5 ميكرولترات من كل إنزيم تقييد. دوامة التفاعل خليط.
واحتضان بين عشية وضحاها في 37.5 درجة مئوية. إعداد رد فعل الثاني لهضم بلازميد المتلقي. في أنبوب 1.5 ملليلتر، والجمع بين 23 ميكرولترات من الماء، وخمسة microliters من المناسبة 10X تقييد الهضم العازلة، 15 ميكرولترات من البلازميد المتلقي، و 1.5 ميكرولترات من كل إنزيم تقييد.
مزيج لفترة وجيزة الأنبوب. واحتضان بين عشية وضحاها في 37.5 درجة مئوية. في اليوم التالي للاستنساخ والتحول، اختر ثلاثة إلى 10 مستعمرات بكتيرية فردية ونقلها إلى ملليلتر واحد من متوسطة LB مع الأمبيسيلين.
احتضان الخلايا لمدة ست ساعات. ثم نقل 200 ميكرولترات من التعليق البكتيري إلى خمسة ملليلتر من متوسطة LB الطازجة مع الأمبيسيلين. احتضان الثقافة في 37.5 درجة مئوية مع اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها.
في اليوم التالي، عزل البلازميد مع مجموعة مصغرة الإعدادية تنقية الحمض النووي. شاشة البلازميد المنقى لنجاح الربط مع PCR. قبل يوم واحد من عملية الانتقال، بذور الخلايا على بولي-L-ليسين المغلفة 96-جيدا لوحة باستخدام متوسطة النسر Dulbecco المعدلة تكملها مع مصل الأبقار الجنين 10٪، 100 وحدة لكل ملليلتر من البنسلين G، و 100 ميكرولتر لكل ملليلتر من بكتيرياtomycin.
فقط إضافة الخلايا إلى 60 الآبار الداخلية لتقليل احتمالية التدرج الحراري عبر لوحة وحافة الآثار من التبخر. أضف 200 ميكرولترات من المياه المقطرة المعقمة إلى الآبار الخارجية الـ 36، و150 ميكرولترات في المساحات بين الآبار. ثم احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 37.5 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
في اليوم التالي، قم بإجراء عملية نقل باستخدام ما مجموعه 100 نانوجرام الحمض النووي. قم بإعداد أربعة مجموعات مختلفة من البلازميد وفقًا لتوجهات المخطوطات. باستخدام 20 ميكرولترات من تعديل النسر وسائل الإعلام الأساسية الحد الأدنى المخزن مع HEPES، و 0.3 ميكرولترات من كاشف الدهون transfection في البئر.
إضافة 20 ميكرولترات من مُكشف نقل الدهون وخليط الحمض النووي لكل بئر، وخلط الطبق في دوائر لمدة 10 ثوانٍ. احتضان لوحة في 37.5 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ست ساعات. تحديث الوسيطة.
واحتضان لمدة 24 ساعة أخرى. بعد الحضانة ، وpirate المتوسطة وإضافة 100 microliters من تعديل النسر وسائل الإعلام الأساسية الحد الأدنى المخزنة مع HEPES إلى كل بئر. السماح للطبق لتحقيق الاستقرار في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
وفي الوقت نفسه، إعداد الركيزة furimazine من خلال الجمع بين حجم واحد من الركيزة 100X مع 19 مجلدات من LCS تخفيف العازلة، وخلق مخزون 5X لخلط مع خلية ثقافة المتوسطة. عندما تكون الخلايا جاهزة، أضف 25 ميكرولترات من المخزون إلى كل بئر، واخلط الطبق بلطف لمدة 10 ثوانٍ. ثم قياس الإنارة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتثبيت الإشارة.
لتجارب مع إضافة ligand، وإعداد حل 13.5X ligand في وسائل الإعلام الأساسية المعدلة النسر المخزنة مع HEPES، وإضافة 10 ميكرولترس في البئر باستخدام ماصة متعددة القنوات. ثم اخلطي الطبق باليد أو مع شاكر مداري. وقد استخدم هذا البروتوكول بنجاح لدراسة التفاعلات بين GPCR النماذجية واثنين من بيتا arrestin isoforms.
تم فحص أربعة تركيبات مختلفة من البلازميد، وتم اختيار واحدة مع أعلى إشارة مضيئة لإجراء المزيد من التجارب. تم تحديد قيم EC50 لكل شكل من أشكال الإيزوفورمات الإزداحية من بيتا،باستخدام منحنيات استجابة الجرعة، والتي تم الحصول عليها من الاستجابة القصوى لكل تركيز من الدراسات الحركية. من المهم للغاية أن تولي اهتمامًا خاصًا عند تصميم الـ PCR التمهيدية.
تطوير الثوابت الصحيحة أمر ضروري لنجاح هذه المقايسات. بعد هذه المنهجية، سوف تكون قادرة على رصد مستقبلات بيتا-arrestin التفاعلات، فضلا عن التفاعلات مستقبلات مع البروتينات السيتوسوليك الأخرى. ستساعد هذه المنهجية على الإجابة على الأسئلة الأساسية في مجال علم الصيدلة GPCR من خلال دراسة كيفية يمكن تعديل تفاعلات GPCR-beta-arrestin عن طريق تعديلات في بنية الرباط.
