このプロトコルは、創薬と開発の分野、特に副作用が最小限の新規、クラス初の薬剤の開発に大きな影響を与えます。この技術の主な利点は、それが任意のGPCRシステムに適用することができ、リアルタイムの生活システムにおける受容体薬理学に関する正確な情報を得るために使用することができるということです。この技術の意味は、特にβ-アレストリンが関連する新しい治療法と密接に関連しています。
これらは、統合失調症の痛みやドーパミン受容体のオピオド受容体が含まれます.この方法は、神経学から心肺疾患まで、多くの医学科学的研究分野で有用である可能性があります。この方法の PCR デモンストレーションは、プロトコルの重要なステップを詳細に表示できるため、従来の公開では不可能であるため、重要です。
まず、pBiT ベクターに関心のある遺伝子を導入するプライマーを設計します。マルチクローニング部位を分割するインフレームストップコドンにより、方向クローニングに必要な2つのユニークな制限酵素の1つとして、3つのサイトのうち少なくとも1つを選択します。リンカー残基をコードし、プライマーに組み込むヌクレオチド配列の原稿を参照してください。
pBiT1.1-CおよびpBiT2.1-Cの場合、フォワードプライマーにATGコドンと強力なコザックコンセンサスシーケンスが含まれていることを確認します。pBiT1.1-N および pBiT2.1-N の場合、逆プライマーにストップ コドンが含まれていることを確認します。設計されたプライマーを使用して、目的の遺伝子のDNAを挿入します。
原稿の方向に従ってPCR試薬を組み合わせ、高忠実度のDNAポリメラーゼを使用して突然変異を最小限に抑えます。サーモサイクラーをプログラムし、反応を開始します。PCRを完了した後、50マイクロリットルの消化反応で製品を消化します。
1.5ミリリットルのチューブに、12マイクロリットルの蒸留水、適切な10X制限消化バッファーの5マイクロリットル、およびPCR産物の30マイクロリットルを組み合わせます。次に、各制限酵素を1.5マイクロリットル加えます。反応混合物を渦液。
そして、摂氏37.5度で一晩インキュベート。レシピエントプラスミドを消化する第二の反応を準備します。1.5ミリリットルのチューブで、23マイクロリットルの水、適切な10X制限消化バッファーの5マイクロリットル、レシピエントプラスミドの15マイクロリットル、および各制限酵素の1.5マイクロリットルを組み合わせます。
チューブを簡単に混ぜます。そして、摂氏37.5度で一晩インキュベート。クローニングと変換の翌日に、3〜10個の細菌コロニーを選び、アンピシリンで1ミリリットルのLB培地に移します。
細胞を6時間インキュベートします。そして、アンピシリンと新鮮なLB培地の5ミリリットルに細菌懸濁液の200マイクロリットルを転送します。一晩で200rpmで振って37.5°Cで培養します。
翌日、プラスミドをミニプレップDNA精製キットで分離します。精製されたプラスミドをスクリーニングし、PCRでライゲーションを成功させます。トランスフェクションの1日前に、10%の胎児ウシ血清、ペニシリンGのミリリットル当たり100単位、ストレプトマイシン1ミリリットル当たり100マイクロリットルを添加したダルベッコの改変イーグル培地を使用して、ポリL-リジンコーティング96ウェルプレートに細胞を播種する。
プレート全体の熱勾配の可能性を最小限に抑えるために、60の内側のウェルに細胞を追加するだけで、蒸発によるエッジ効果が生じる可能性があります。36個の外側の井戸に200マイクロリットルの無菌蒸留水を加え、井戸間のスペースに150マイクロリットルを加えます。その後、摂氏37.5度と5%の二酸化炭素で一晩プレートをインキュベートします。
翌日、合計100ナノグラムのDNAを用いてトランスフェクションを行う。原稿の指示に従って4つの異なるプラスミドの組み合わせを設定します。HEPESで緩衝された変更されたイーグルの最低必須培地の20マイクロリットルを使用し、そして、ウェルあたり脂質トランスフェクション試薬の0.3マイクロリットルを使用する。
各ウェルに20マイクロリットルの脂質トランスフェクション試薬とDNA混合物を加え、プレートを円で10秒間混ぜます。プレートを摂氏37.5度、炭酸ガス5%で6時間インキュベートします。メディアを更新します。
さらに24時間インキュベートします。インキュベーション後、培地を吸引し、HEPESで緩衝した変更されたイーグルの最小必須培地を100マイクロリットルずつ各ウェルに加えます。プレートを室温で10分間安定させます。
一方、100X基質の1体積をLCS希釈バッファーの19容量と組み合わせて、5Xストックを作成して細胞培養液と混合して、フリマジン基質を調製する。細胞の準備ができたら、ストックの25マイクロリットルを各ウェルに加え、プレートを10秒間静かに混ぜます。次に、信号安定化のために室温で10分間発光を測定します。
リガンド添加の実験では、13.5Xリガンド溶液をHEPESで緩衝した変更Eagleの最小必須培地に調製し、マルチチャネルピペットを使用して1ウェルあたり10マイクロリットルを添加します。その後、手で、または軌道シェーカーでプレートを混合します。このプロトコルは、原型GPCRと2つのβ-アスタミンアイソフォーム間の相互作用を研究するためにうまく使用されています。
4つの異なるプラスミドの組み合わせをスクリーニングし、さらに実験のために最も高い発光信号を有する1つを選択した。各β-アレスチンアイソフォームのEC50値は、用量応答曲線を用いて決定した。PCR プライマーを設計する際には、特に注意を払う必要があります。
これらのアッセイの成功には、正しい構造の開発が不可欠です。この方法論に従って、受容体-β-アレプチン相互作用、ならびに他の細胞質タンパク質との受容体相互作用を監視することができます。この方法論は、GPCR-β-アレストイン相互作用がリガンド構造の修飾によってどのように変調できるかを研究することによって、GPCR薬理学の分野における基本的な質問に答えるのに役立ちます。
