Este protocolo tiene un alto impacto en el campo del descubrimiento y desarrollo de fármacos, especialmente en el desarrollo de nuevos fármacos de primera clase con efectos secundarios mínimos. La principal ventaja de esta técnica es que se puede aplicar a cualquier sistema GPCR, y se utiliza para obtener información precisa sobre la farmacología de los receptores en sistemas de vida en tiempo real. Las implicaciones de esta técnica están estrechamente relacionadas con nuevas terapias, especialmente cuando las beta-arrestinas son relevantes.
Estos incluyen receptores opioados en el dolor y receptores de dopamina en la esquizofrenia. Este método puede ser útil en muchas áreas de investigación científica médica desde la neurología hasta la enfermedad cardiopulmonar. La demostración PCR de nuestro método es importante, ya que permite una presentación detallada de los pasos críticos en el protocolo, que no serían posibles con la publicación convencional.
Comience diseñando imprimaciones para introducir genes de interés para los vectores pBiT. Debido al codón de parada en estructura que divide el sitio de clonación múltiple, seleccione al menos uno de los tres sitios como una de las dos enzimas de restricción únicas necesarias para la clonación direccional. Consulte el manuscrito para ver las secuencias de nucleótidos para codificar los residuos del vinculador e incorporarlos a las imprimaciones.
Para el pBiT1.1-C y pBiT2.1-C asegúrese de que la imprimación delantera contiene un codón ATG y una potente secuencia de consenso Kozak. Para el pBiT1.1-N y pBiT2.1-N asegúrese de que la imprimación inversa contiene un codón de parada. Utilice las imprimaciones diseñadas para amplificar el ADN de inserción del gen de interés.
Combine los reactivos PCR de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, asegurándose de utilizar una polimerasa de ADN de alta fidelidad para minimizar las mutaciones. Programe el termociclador e inicie la reacción. Después de completar la PCR, digiere el producto en una reacción de digestión de 50 microlitros.
En un tubo de 1,5 mililitros, combine 12 microlitros de agua destilada, cinco microlitros del tampón de digestión de restricción 10X apropiado y 30 microlitros del producto PCR. A continuación, agregue 1,5 microlitros de cada enzima de restricción. Vórtice la mezcla de reacción.
Y incubar durante la noche a 37,5 grados centígrados. Preparar una segunda reacción para digerir el plásmido receptor. En un tubo de 1,5 mililitros, combine 23 microlitros de agua, cinco microlitros del tampón de digestión de restricción 10X apropiado, 15 microlitros del plásmido receptor y 1,5 microlitros de cada enzima de restricción.
Mezcle brevemente el tubo. Y incubar durante la noche a 37,5 grados centígrados. Al día siguiente de la clonación y transformación, elija de tres a 10 colonias bacterianas individuales y transfieralas a un mililitro de medio LB con ampicilina.
Incubar las células durante seis horas. Y luego transferir 200 microlitros de suspensión bacteriana a cinco mililitros de nuevo LB medio con ampicilina. Incubar el cultivo a 37,5 grados centígrados con temblores a 200 rpm durante la noche.
Al día siguiente, aísle el plásmido con un kit de purificación de ADN de mini-prep. A prueba el plásmido purificado para una ligadura exitosa con PCR. Un día antes de la transfección, sembrar las células en una placa de 96 pocillos recubierta de poli-L-lisina usando el medio modificado de eagle de Dulbecco complementado con 10% de suero bovino fetal, 100 unidades por mililitro de penicilina G y 100 microlitros por mililitro de estreptomicina.
Sólo agregue células a los 60 pozos interiores para minimizar el potencial de gradientes térmicos a través de la placa y los efectos de borde de la evaporación. Añadir 200 microlitros de agua destilada estéril a los 36 pozos exteriores, y 150 microlitros en los espacios entre los pozos. Luego incubar la placa durante la noche a 37,5 grados Centígrados y 5% de dióxido de carbono.
Al día siguiente, realice la transfección utilizando un total de 100 nanogramos de ADN. Configure cuatro combinaciones diferentes de plásmido según las instrucciones del manuscrito. Usando 20 microlitros de medios esenciales mínimos modificados de Eagle amortiguados con HEPES, y 0,3 microlitros de reactivo de transfección lipídica por pozo.
Añadir 20 microlitros de reactivo de transfección lipídica y mezcla de ADN a cada pocólite, y mezclar la placa en círculos durante 10 segundos. Incubar la placa a 37,5 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante seis horas. Actualice el medio.
Y incubar otras 24 horas. Después de la incubación, aspirar el medio y añadir 100 microlitros de medios esenciales mínimos modificados de Eagle amortiguados con HEPES a cada pocóteo. Deje que la placa se estabilice a temperatura ambiente durante 10 minutos.
Mientras tanto, preparar el sustrato de furimazina combinando un volumen del sustrato 100X con 19 volúmenes de tampón de dilución LCS, creando un stock 5X para mezclar con el medio de cultivo celular. Cuando las células estén listas, agregue 25 microlitros del caldo a cada pozo y mezcle suavemente la placa durante 10 segundos. A continuación, mida la luminiscencia durante 10 minutos a temperatura ambiente para la estabilización de la señal.
Para experimentos con la adición de ligandos, prepare la solución de ligando 13.5X en medios esenciales mínimos de Eagle modificados almacenados en búfer con HEPES, y agregue 10 microlitros por pozo usando una pipeta multicanal. A continuación, mezcle la placa a mano o con un agitador orbital. Este protocolo se ha utilizado con éxito para estudiar las interacciones entre un GPCR prototípico y dos isoformas beta-arrestin.
Se proyectaron cuatro combinaciones diferentes de plásmido, y la que tenía la señal luminiscente más alta fue seleccionada para otros experimentos. Los valores EC50 para cada isoforma beta-arrestin se determinaron utilizando curvas de dosis-respuesta, que se obtuvieron de la respuesta máxima de cada concentración de estudios cinéticos. Es fundamental prestar especial atención al diseñar las imprimaciones PCR.
El desarrollo de las construcciones adecuadas es esencial para el éxito de estos ensayos. Siguiendo esta metodología, usted será capaz de monitorear las interacciones receptor-beta-arrestin, así como las interacciones de los receptores con otras proteínas citosólicas. Esta metodología ayudará a responder preguntas fundamentales en el campo de la farmacología GPCR mediante el estudio de cómo las interacciones GPCR-beta-arrestin pueden ser moduladas por modificaciones en la estructura del ligando.
