Этот протокол имеет большое влияние в области обнаружения и разработки лекарственных средств, особенно в разработке новых, первоклассных препаратов с минимальными побочными эффектами. Основным преимуществом этого метода является то, что он может быть применен к любой системе GPCR, и используется для получения точной информации о рецепторной фармакологии в режиме реального времени живых систем. Последствия этого метода тесно связаны с новыми методами лечения, особенно там, где бета-арестины актуальны.
К ним относятся опиодные рецепторы при болях и рецепторы допамина при шизофрении. Этот метод может быть полезен во многих областях медицинских научных исследований от неврологии до сердечно-легочных заболеваний. ПЦР демонстрация нашего метода важна, так как позволяет детально иззнать критические шаги в протоколе, что было бы невозможно при обычной публикации.
Начните с проектирования праймеров, чтобы ввести гены, представляющие интерес для векторов pBiT. Из-за кодона остановки inframe, разделяя место мульти клонирования, выберите по крайней мере один из трех участков в качестве одного из двух уникальных ферментов ограничения, необходимых для направленного клонирования. Обратитесь к рукописи для нуклеотидных последовательностей, чтобы кодировать остатки связующего звена и включать их в грунтовки.
Для pBiT1.1-C и pBiT2.1-C убедитесь, что форвард праймер содержит кодон ATG и мощный козак консенсуса последовательности. Для pBiT1.1-N и pBiT2.1-N убедитесь, что обратная грунтовка содержит стоп-кодон. Используйте разработанные грунтовки для усиления вставки ДНК гена, представляющий интерес.
Объедините реагенты ПЦР в соответствии с рукописными указаниями, убедившись, что использовать полимеразу ДНК высокой точности, чтобы свести к минимуму мутации. Запрограммировать термоциклер и начать реакцию. После завершения ПЦР, переварить продукт в 50-микролитровой реакции пищеварения.
В 1,5-миллилитровой трубке смешайте 12 микролитров дистиллированной воды, пять микролитров соответствующего буфера пищеварения ограничения 10X и 30 микролитров продукта ПЦР. Затем добавьте 1,5 микролитров каждого фермента ограничения. Вихрь реакционной смеси.
И инкубировать на ночь при 37,5 градусах по Цельсию. Подготовь вторую реакцию, чтобы переварить плазмиду реципиента. В 1,5-миллилитровой трубке смешайте 23 микролитров воды, пять микролитров соответствующего буфера пищеварения ограничения 10X, 15 микролитров плазмиды реципиента и 1,5 микролитров каждого фермента ограничения.
Кратко перемешайте трубку. И инкубировать на ночь при 37,5 градусах по Цельсию. На следующий день после клонирования и преобразования, выбрать от трех до 10 отдельных бактериальных колоний и передать их в один миллилитр LB среды с ампициллином.
Инкубировать клетки в течение шести часов. А затем перенесите 200 микролитров бактериальной суспензии на пять миллилитров свежей среды LB с ампициллином. Инкубировать культуру на 37,5 градусов по Цельсию с встряхивания на 200 об / мин в одночасье.
На следующий день изолируйте плазмиду с помощью мини-подготовки комплекта для очистки ДНК. Экран очищенной плазмиды для успешной перевязки с ПЦР. За день до трансфекции, семена клеток на поли-L-лизин покрытием 96-хорошо пластины с использованием Dulbecco модифицированных Eagle среды дополняется 10%fetal бычьей сыворотки, 100 единиц на миллилитр пенициллина G, и 100 микролитров на миллилитр стрептомицина.
Только добавить клетки в 60 внутренних скважин, чтобы свести к минимуму потенциал для тепловых градиентов по всей пластине и края эффекты от испарения. Добавьте 200 микролитров стерильной дистиллированной воды в 36 внешних скважин и 150 микролитров в пространства между скважинами. Затем инкубировать пластину на ночь при 37,5 градусах по Цельсию и 5%углекислом газе.
На следующий день выполните трансфекцию, используя в общей сложности 100 нанограмм ДНК. Настройка четырех различных плазмидных комбинаций в соответствии с рукописными направлениями. Использование 20 микролитров модифицированных орлиных минимальных необходимых средств массовой информации буферизированы с HEPES, и 0,3 микролитров липидных реагентов трансфекции на колодец.
Добавьте по 20 микролитров липидного трансфектического реагента и смеси ДНК в каждую колодец и смешайте пластину по кругу в течение 10 секунд. Инкубировать пластину при 37,5 градусах по Цельсию и 5%углекислом газе в течение шести часов. Освежите среду.
И инкубировать еще 24 часа. После инкубации, аспирировать среды и добавить 100 микролитров модифицированных Eagle минимально необходимых средств массовой информации буфера с HEPES для каждой хорошо. Дайте пластине стабилизироваться при комнатной температуре в течение 10 минут.
Между тем, подготовить фуримазин субстрат путем объединения одного тома 100X субстрата с 19 томами буфера разбавления LCS, создавая 5X запас смешиваться со средой клеточной культуры. Когда клетки будут готовы, добавьте 25 микролитров бульона к каждой хорошо, и аккуратно смешайте пластину в течение 10 секунд. Затем измерьте люминесценцию в течение 10 минут при комнатной температуре для стабилизации сигнала.
Для экспериментов с добавлением лиганда подготовьте 13,5X лигандовое решение в модифицированных необходимых средствах массовой информации Eagle, буферизированных с HEPES, и добавьте 10 микролитров на колодец с помощью многоканальной пипетки. Затем смешайте пластину вручную или с орбитальным шейкером. Этот протокол был успешно использован для изучения взаимодействий между прототипом GPCR и двумя бета-арестин изоформами.
Для дальнейших экспериментов были проверены четыре различные плазмидные комбинации, а также одна с самым высоким люминесцентным сигналом. Значения EC50 для каждого бета-арестина изоформы были определены с использованием кривых реакции дозы, которые были получены из максимальной реакции каждой концентрации от кинетических исследований. Очень важно уделять особое внимание при проектировании праймеров PCR.
Развитие правильных конструкций имеет важное значение для успеха этих анализов. Следуя этой методологии, вы сможете контролировать рецептор-бета-арестин взаимодействия, а также взаимодействия рецепторов с другими цитозолями белками. Эта методология поможет ответить на фундаментальные вопросы в области фармакологии GPCR, изучая, как взаимодействия GPCR-бета-аресттина могут модулироваться изменениями в структуре лиганда.
