פרוטוקול זה יש השפעה גבוהה בתחום גילוי ופיתוח סמים, במיוחד בפיתוח של תרופות חדשניות, ראשון מסוגו עם תופעות לוואי מינימליות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה יכול להיות מיושם על כל מערכת GPCR, ושמש כדי לקבל מידע מדויק על פרמקולוגיה קולטן במערכות חיים בזמן אמת. ההשלכות של טכניקה זו קשורות קשר הדוק לטיפולים חדשים במיוחד כאשר בטא-עצורים רלוונטיים.
אלה כוללים קולטני אופיוד בכאב, קולטני דופמין בסכיזופרניה. שיטה זו יכולה להיות שימושית בתחומים רבים של מחקר מדעי רפואי מנוירולוגיה למחלות לב וכלי דם. הדגמת PCR של השיטה שלנו חשובה, כי זה מאפשר הצגה מפורטת של השלבים הקריטיים בפרוטוקול, אשר לא יהיה אפשרי עם פרסום קונבנציונלי.
התחל בתכנון פריימרים כדי להציג גנים מעניינים לווקטורים pBiT. בשל קודון עצירת המסגרת המחלק את האתר מרובה השיבוטים, בחר לפחות באחד משלושת האתרים כאחד משני אנזימי ההגבלה הייחודיים הדרושים לשיבוט כיווני. עיין בכתב היד עבור רצפי נוקלאוטידים כדי לקודד את שאריות המקשר ולשלב אותם לתוך פריימרים.
עבור pBiT1.1-C ו pBiT2.1-C לוודא כי פריימר קדימה מכיל קודון ATG ורצף קונצנזוס קוזאק חזק. עבור pBiT1.1-N ו pBiT2.1-N ודא כי פריימר הפוך מכיל קודון עצירה. השתמש פריימרים מעוצבים כדי להגביר את DNA הכנס של הגן של עניין.
שלב את רייגנטים PCR על פי הוראות כתב יד, הקפד להשתמש פולימראז DNA נאמנות גבוהה כדי למזער מוטציות. תכנת את התרמוצ'ילר ותתחיל את התגובה. לאחר השלמת PCR, לעכל את המוצר בתגובת עיכול 50 מיקרוליטר.
בצינור 1.5 מיליליטר, לשלב 12 microliters של מים מזוקקים, חמישה microliters של מאגר עיכול הגבלת 10X המתאים, ו 30 microliters של מוצר PCR. לאחר מכן הוסיפו 1.5 מיקרוליטרים של כל אנזים הגבלה. וורטקס תערובת התגובה.
ודגירה לילה ב37.5 מעלות צלזיוס. הכינו תגובה שנייה לעיכול הפלסמיד של המטופל. בצינור 1.5 מיליליטר, לשלב 23 microliters של מים, חמישה microliters של מאגר עיכול הגבלת 10X המתאים, 15 microliters של פלסמיד הנמען, ו 1.5 microliters של כל אנזים הגבלה.
מערבבים בקצרה את הצינור. ודגירה לילה ב37.5 מעלות צלזיוס. ביום שלאחר השיבוט והטרנספורמציה, בחרו שלוש עד עשר מושבות חיידקים בודדות והעבירו אותן למיליליטר אחד של מדיום LB עם אמפיצילין.
דגירה התאים במשך שש שעות. ואז להעביר 200 microliters של השעיה חיידקית לחמישה מיליליטר של מדיום LB טרי עם אמפיצילין. הדגירה את התרבות ב 37.5 מעלות צלזיוס עם רעידות ב 200 סל"ד לילה.
ביום שלמחרת, לבודד את הפלסמיד עם ערכת טיהור DNA מיני הכנה. מסך פלסמיד מטוהרים עבור קשירה מוצלחת עם PCR. יום אחד לפני ההטמקה, זרע את התאים על צלחת פולי-L-ליסין מצופה 96 בארות באמצעות מדיום הנשר שונה של Dulbecco בתוספת 10% סרום שור עוברי, 100 יחידות למיליליטר של פניצילין G, ו 100 microliters למיליליטר של סטרפטומיצין.
הוסף תאים רק ל-60 בארות הפנימיות כדי למזער את הפוטנציאל למילויים הדרגתיים תרמיים לאורך הלוח ואפקטי קצה מאידוי. הוסיפו 200 מיקרוליטרים של מים מזוקקים סטריליים ל-36 בארות החיצוניות, ו-150 מיקרוליטרים לחללים שבין בארות. ואז להת הדגירה את הצלחת לילה ב 37.5 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.
ביום שלמחר, לבצע transfection באמצעות סך של 100 DNA ננוגרם. הגדר ארבעה שילובי פלסמיד שונים על פי הוראות כתב היד. באמצעות 20 microliters של מדיה חיונית מינימלית של הנשר שונה במאגר עם HEPES, ו 0.3 microliters של רגנט transfection השומנים לכל באר.
מוסיפים 20 מיקרוליטרים של רגנט טרנספרפיד ליפידי ותערובת DNA לכל באר, ומערבבים את הצלחת במעגלים במשך 10 שניות. דגירה הצלחת ב 37.5 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך שש שעות. רענן את המדיום.
ותתגרה עוד 24 שעות. לאחר הדגירה, שאפו את המדיום והוסיפו 100 מיקרוליטרים של המדיה החיונית המינימלית של הנשר שעברה אגירה עם HEPES לכל באר. אפשר לצלחת להתייצב בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
בינתיים, להכין את המצע furimazine על ידי שילוב נפח אחד של מצע 100X עם 19 כרכים של מאגר דילול LCS, יצירת מלאי 5X לערבב עם מדיום תרבות התא. כאשר התאים מוכנים, מוסיפים 25 מיקרוליטרים של המניה לכל באר, ומערבבים בעדינות את הצלחת במשך 10 שניות. לאחר מכן למדוד את אור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לייצוב אות.
לניסויים עם תוספת ליגנד, הכינו את פתרון הליגנד פי 13.5 במדיה החיונית המינימלית של Eagle עם HEPES, והוסיפו 10 מיקרוליטרים לעין באמצעות פיפטה רב-ערוצית. ואז לערבב את הצלחת ביד או עם שייקר מסלולית. פרוטוקול זה שימש בהצלחה לחקר אינטראקציות בין GPCR prototypical ושני isoforms בטא-arrestin.
ארבעה צירופי פלסמיד שונים הוקרנו, וזה עם האות הגבוה ביותר שנבחר לניסויים נוספים. ערכי EC50 עבור כל איזופורם בטא-arrestin נקבעו באמצעות עקומות תגובה מינון, אשר התקבלו מן התגובה המרבית של כל ריכוז מחקרים קינטיים. זה קריטי להקדיש תשומת לב מיוחדת בעת עיצוב פריימרים PCR.
פיתוח המבנים הנכונים חיוני להצלחתם של מתנאים אלה. בעקבות מתודולוגיה זו, תוכל לפקח על אינטראקציות קולטן-בטא-arrestin, כמו גם אינטראקציות קולטן עם חלבונים ציטוסוליים אחרים. מתודולוגיה זו תסייע לענות על שאלות בסיסיות בתחום הפרמקולוגיה GPCR על ידי לימוד כיצד אינטראקציות GPCR-בטא-arrestin ניתן לווסת על ידי שינויים במבנה ligand.
