وهذا قد يفيد في المساعدة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول كيفية توليف جزيئات DCAF مع تحييد الأجسام المضادة المستهدفة. توفر هذه التقنية أبسط طريقة لتجميع جزيئات DCAF مع إنتاجية عالية. يقرر العالم أن جزيئات DCAF لديها التدخلات المحتملة للأجسام المضادة في التعامل مع أمراض مثل حمى الضنك والذرة العضلية.
ويمكن تطبيق هذه الطريقة على جزيئات DCAF الأخرى مع epitopes مختلفة لاستهداف الأجسام المضادة cognate. إثبات الإجراء سيكون شيويه باي، وهو فني كبير من مختبري. لتحويل راتنج 2-الكلور إلى هيدروزين مشتقة 2-الكلور الراتنج، من أعلى وعاء التوليف الببتيد، إضافة خمسة ملليلتر من DMF إلى 0.25 ملليمول من راتنج 2-الكلور.
ضع الغطاء مرة أخرى على، يهز بلطف السفينة لمدة 15 ثانية، ومن ثم استنزاف على موقف الحديد. كرر غسل DMF مرتين اُلّاً. ثم إضافة خمسة ملليلتر من DCM إلى السفينة، ووضع الغطاء مرة أخرى على، يهز بلطف السفينة لمدة 15 ثانية، ثم استنزاف على موقف الحديد.
كرر غسل DCM مرتين االأكثر، ثم كرر غسل DMF ثلاث مرات أخرى. بعد ذلك، إضافة ستة ملليلتر من 50٪ تركيز حجم DMF على DCM لتضخم الراتنج لمدة 30 دقيقة ومن ثم استنزافه. الآن نقل ستة ملليلتر من 5٪ حجم تركيز هيدرازين وDMF إلى وعاء التفاعل.
وضعه على شاكر في 120 دورة في الدقيقة و 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم استنزاف الحل عن طريق مضخة فراغ. لتنقية مشتق هيدرازين من ببتيد FC-III، استخدم نظام HPLC لتنقية الببتيد عن طريق 30 دقيقة من التلميحات المتدرجة بمعدل تدفق ميليلتر واحد في الدقيقة. بعد تنقية البروتين وفقا للمخطوطة، إضافة إلى أنبوب جديد ملليلتر من ملليغرام واحد لكل ملليلتر سومو الموسومة البروتين، ومليلتر واحد من بروتياز سومو، وميليلتر واحد من 10X سومو protease العازلة، وستة ملليلتر من الماء المقطر مزدوجة لإعداد حل التفاعل.
احتضان الخليط لمدة 12 إلى 16 ساعة في أربع درجات مئوية. ثم aliquot الخليط في ثمانية 1.5 ملليلتر Eppendorf أنابيب، والطرد المركزي الخليط في 15، 000 مرات G لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية. استخدام الأنابيب لتجاهل المجاميع في الجزء السفلي، ثم في 10 ملليلتر مسح supernatants، إضافة 0.5 ملليلتر من 50٪ النيكل NTA الخرز الطين في 50 ملليمولار PBS.
ضع الأنبوب عند شاكر دوار عند 200 دورة في الدقيقة وأربع درجات مئوية لخلطه بلطف لمدة 60 دقيقة. المقبل، تحميل ليزاد والنيكل NTA خليط في عمود مع سقف منفذ أسفل. إزالة الغطاء السفلي وحفظ تدفق من خلال إلى أنبوب جهاز طرد مركزي 15 ملليلتر.
بروتين SUMO له TAG هو ملزم على العمود. جزء مستضد الرابط ، الذي يبدأ مع رابطة الدول المستقلة لتفاعل الربط الكيميائي الأصلي ، هو في التدفق من خلال. الآن الوزن 1.8 ملليغرام من مشتق هيدرازين من ببتيد Fc-III في أنبوب Eppendorf milliliter اثنين وإضافة 0.8 ملليلتر من ستة كلوريد غواندينيوم مولار في 0.2 مولار محلول فوسفات أحادي الصوديوم في pH 3.
دوامة لإذابة المسحوق. بعد الطرد المركزي للأنبوب في 7، 200 مرات G لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة نقل سوبرناتبيرت إلى أنبوب جديد. إضافة شريط ضجة في أنبوب ووضع الأنبوب في حمام ملح الجليد على مُحرك مغناطيسي لإثارة الحل لطيف لمدة 15 دقيقة.
ثم إضافة 40 ميكرولترات من 0.5 نيتريت الصوديوم الضرس إلى حل لأكسدة مجموعة هيدرازين. يهيج بلطف الحل لمدة 15 دقيقة أخرى في حمام الملح الجليدي. تزن في 11 ملليغرام من HPLC تنقية وتجميد المجففة رابط مستضد جزء, و 13.6 ملليغرام من MPAA في أنبوب التفاعل في حمام ملح الجليد.
اثارة لمدة خمس دقائق ثم ضبط قيمة درجة اله PH إلى 6.8 إلى 7.0 في غرفة معتدلة مع ستة هيدروكسيد الصوديوم الضرس. الخطوة الأكثر أهمية للسلّ الربط الكيميائي الأصلي هو ضبط قيمة درجة PH بعناية لبدء تفاعل الربط. بعد 12 ساعة في حمام ملح الثلج، إضافة 0.4 ملليلتر من 0.1 المولى TCEP الحل محايدة لنظام رد الفعل، ويحرك لمدة 20 دقيقة لإنهاء رد الفعل.
بعد الطرد المركزي وتنقية HPLC، الحصول على ذروة اقتران الثالث لل desulfurization. تذوب في 50 ميكرولتردات من ستة كلوريد غواندينيوم المولار في 0.2 مولار محلول فوسفات الصوديوم الأحادي. ثم إضافة 50 microliters من واحد TCEP الضرس، 10 ميكرولترات من ثلاثية-بوتيلثيوول، وخمسة ميكرولترات من 0.1 مولار VAO لأربعة حل.
ضبط درجة الH النهائي من الحل إلى 6.9 والحفاظ على الحل في 37 درجة مئوية على شاكر لمدة خمس ساعات تقريبا. الطرد المركزي وتنقية مرة أخرى. يُحل الببتيد المُعد في 200 ميكرولترات من خلات الفضة 32 ملليمولار، ثم يُحرّك خليط التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة أربع ساعات.
لتحويل ثيولاتس الفضة على الببتيد إلى ثيول مجانا، إضافة ثلاثة ميكرولترات من دات واحد مول في ستة كلوريد غواندينيوم المولار، و 0.2 فوسفات أحادية الصوديوم المولر في 7 pH. تشغيل مطياف الكتلة في وضع المسح الضوئي الكامل وتعيين نطاق m / z في 300 إلى 2، 000، والقرار في 60،000. فتح بيانات الأطياف الكتلة والعثور على قمم المنتج في كل خطوة للتأكد من أن يتم تنفيذ التفاعل الكيميائي بنجاح.
لأداء فحص ELISA للتفاعل بين الأجسام المضادة DCAF1 و 4G2 ، معطف كل بئر من لوحة 96-جيدا microtiter مع picomole واحد من الأجسام المضادة مضادة ا لجيست في 100 ميكرولترات من العازلة طلاء. ختم لوحة مع أشرطة الختم واحتضان في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها على شاكر. في كتلة الصباح كل بئر مع 200 microliters من 1٪ BSA وBBS.
ختم لوحة واحتضان غرفة المعتدلة لمدة ساعة واحدة على شاكر. ثم استخدام برنامج تلفزيوني مع 0.05٪ توين 20 لغسل كل أربع مرات. في هذا البروتوكول تم استخدام طريقة الربط الكيميائي الأصلي لأشباه جزيء DCAF1.
الطيف الشامل يظهر جزيء DCAF1 النهائي لديه وزن الجزيئية deconvolutional من 11، 053. خلال فحص ELISA ، يمنع مستضد الببتيد Fc-III و DCAF1 بشكل تنافسي ربط الأجسام المضادة 4G2. كل من الببتيد المستضد وDCAF1 منعت بشكل كبير 4G2 ملزمة في حين أن ببتيت FC-III لم يؤثر على التفاعل مستضد الأجسام المضادة.
بعد هذا التطور ، مهدت هذه التقنية الطريق لتدخل الأمراض الضارة المرتبطة بالأجسام المضادة. الكثير من المناطق المستخدمة في تركيب الببتيد وربط المواد الكيميائية الأصلية هي شديدة السمية. تأكد من إجراء هذه التجارب في غطاء محرك السيارة الكيميائي.
