Cela pourrait aider à répondre à des questions clés sur la façon de synthétiser les molécules DCAF avec la neutralisation ciblée des anticorps. Cette technique fournit le moyen le plus simple de synthétiser les molécules DCAF avec une productivité élevée. Le monde décide que les molécules du DCAF ont les interventions potentielles à l’anticorps dans le traitement de maladies telles que la dengue et la myasthénie gravis.
Cette méthode peut être appliquée à d’autres molécules du DCAF avec différents épitopes pour cibler les anticorps cognés. Xue Bai, technicien principal de mon laboratoire, démontrera la procédure. Pour convertir la résine de 2 chlore en résine 2 chlore dérivée de l’hydrazine, du haut du récipient de synthèse peptidique, ajoutez cinq millilitres de DMF aux 0,25 millimoles de résine de 2 chlore.
Remettre le bouchon, secouer doucement le récipient pendant 15 secondes, puis le égoutter sur un support en fer. Répétez le lavage DMF deux fois de plus. Ajouter ensuite cinq millilitres de DCM au navire, remettre le bouchon, secouer doucement le récipient pendant 15 secondes, puis le vider sur un support en fer.
Répétez le lavage DCM deux fois de plus, puis répétez le lavage DMF trois fois de plus. Ensuite, ajoutez six millilitres de concentration de 50% de volume de DMF sur DCM pour gonfler la résine pendant 30 minutes, puis égouttez-la. Transférez maintenant six millilitres de concentration en volume de 5 % d’hydrazine et de DMF au vaisseau réactionnaire.
Placez-le sur le shaker à 120 RPM et 30 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis égouttez la solution par pompe à vide. Pour purifier le dérivé hydrazine d’un peptide Fc-III, utilisez le système HPLC pour purifier le peptide par une elution d’allusion de gradient de 30 minutes à un débit d’un millilitre par minute. Après purification des protéines selon le manuscrit, ajouter dans un nouveau tube deux millilitres d’un milligramme par millilitre sumo marqué protéine, un millilitre de protéase SUMO, un millilitre de tampon de protéase SUMO 10X, et six millilitres d’eau distillée double pour préparer la solution de réaction.
Incuber le mélange de 12 à 16 heures à quatre degrés Celsius. Ensuite, aliquot le mélange en huit tubes Eppendorf de 1,5 millilitre, et centrifuger le mélange à 15.000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Utilisez un pipet pour jeter les agrégats au fond, puis dans les supernatants défrichés de 10 millilitres, ajouter 0,5 millilitres de la boue de perles NTA de 50 % nickel dans 50 millimolaires PBS.
Placer le tube à un shaker rotatif à 200 rpm et quatre degrés Celsius pour mélanger doucement pendant 60 minutes. Ensuite, chargez le lisade et le mélange nickel NTA dans une colonne avec le bouchon de sortie inférieur. Retirez le bouchon inférieur et économisez le flux dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres.
La protéine HIS TAG SUMO est contraignante sur la colonne. La partie antigène linker, qui commence avec la CEI pour la réaction de ligature chimique indigène, est dans le flux à travers. Maintenant, le poids 1,8 milligrammes de dérivé hydrazine d’un peptide Fc-III dans un tube eppendorf de deux millilitres et ajouter 0,8 millilitres de six guanidinium chlorure molaire dans 0,2 molar solution de phosphate monosodique au pH 3.
Vortex pour dissoudre la poudre. Après avoir centrifugé le tube à 7200 fois G pendant une minute à température ambiante transférer le supernatant dans un nouveau tube. Ajouter une barre de remue-glace dans le tube et mettre le tube dans un bain de sel de glace sur un agitateur magnétique pour agiter doucement la solution pendant 15 minutes.
Ajouter ensuite 40 microlitres de nitrite de sodium molaire de 0,5 molaire à la solution pour oxyder le groupe hydrazine. Agiter doucement la solution pendant encore 15 minutes dans le bain de sel de glace. Peser à 11 milligrammes de la partie antigène de liaison purifié et lyophilisé HPLC, et 13,6 milligrammes de MPAA dans le tube de réaction dans le bain de sel de glace.
Remuer pendant cinq minutes, puis ajuster la valeur du pH à 6,8 à 7,0 à la chambre tempérée avec six hydroxyde de sodium molaire. L’étape la plus critique pour la ligature chimique indigène est d’ajuster la valeur de pH soigneusement pour initier la réaction de ligature. Après 12 heures dans le bain de sel de glace, ajouter 0,4 millilitres de 0,1 molar TCEP solution neutre au système de réaction, et remuer pendant 20 minutes pour mettre fin à la réaction.
Après centrifugation et purification hplc, obtenir le pic conjugué III pour la désulfuration. Dissolvez-le dans 50 microlitres de six chlorure molaire de guanidinium dans la solution molaire de phosphate de monosodium. Ajoutez ensuite 50 microlitres d’un TCEP molaire, 10 microlitres de tert-Butylthiol et cinq microlitres de 0,1 VAO molaire pour quatre solutions.
Ajustez le pH final de la solution à 6,9 et maintenez la solution à 37 degrés Celsius sur un shaker pendant environ cinq heures. Centrifugeuse et purifier à nouveau. Dissoudre le peptide préparé en 200 microlitres d’acétate d’argent de 32 millimlaires, puis remuer le mélange de réaction à température ambiante pendant quatre heures.
Pour convertir les thiolates d’argent sur le peptide en thiols libres, ajoutez trois microlitres d’une molaire DTT dans six chlorure molaires de guanidinium, et 0,2 phosphate monosodique molaire au pH 7. Actionnez le spectromètre de masse en mode scan complet et réglez la plage m/z à 300 à 2000, et la résolution à 60 000. Ouvrez les données des spectres de masse et trouvez les pics du produit à chaque étape pour confirmer que la réaction chimique est effectuée avec succès.
Pour effectuer l’analyse ELISA de l’interaction entre l’anticorps DCAF1 et 4G2, enduire chaque puits d’une plaque de microtiter de 96 puits avec un picomole d’anticorps anti-TPS dans 100 microlitres de tampon de revêtement. Sceller la plaque avec des rubans d’étanchéité et l’incuber à 4 degrés Celsius pendant la nuit sur un shaker. Dans le bloc du matin chaque puits avec 200 microlitres de 1%BSA et PBS.
Sceller la plaque et l’incuber tempérée pendant une heure sur un shaker. Ensuite, utilisez PBS avec 0,05%Tween 20 pour laver chaque puits quatre fois. Dans ce protocole, la méthode de ligature chimique indigène a été utilisée pour la semisynthèse de la molécule DCAF1.
Le spectre de masse montre que la molécule finale DCAF1 a un poids moléculaire déconvolutionnel de 11 053. Pendant l’essai ELISA, le peptide antigène Fc-III et le DCAF1 inhibent de façon compétitive la liaison anticorps 4G2. Le peptide d’antigène et le DCAF1 ont sensiblement bloqué la liaison 4G2 tandis que le peptite de Fc-III n’a pas affecté l’interaction d’anticorps d’antigène.
Après ce développement, cette technique a ouvert la voie à une intervention de maladies nocives associées aux anticorps. Lot des régions utilisées pour la synthèse peptidique et la ligature chimique indigène sont très toxiques. Assurez-vous de prendre ces expériences dans votre hotte chimique.
