Isso pode servir para ajudar a responder perguntas-chave sobre como sintetizar moléculas de DCAF com a neutralização de anticorpos direcionados. Esta técnica fornece a maneira mais simples de sintetizar as moléculas dcaf com alta produtividade. O mundo decide que as moléculas da DCAF têm as possíveis intervenções ao anticorpo em lidar com doenças como a dengue e a miasthenia gravis.
Este método pode ser aplicado a outras moléculas de DCAF com diferentes epítopos para atingir os anticorpos cognatos. Demonstrando o procedimento será Xue Bai, um técnico sênior do meu laboratório. Para converter resina de 2 cloro em resina derivada de hidrazina 2-Cloro, do topo do vaso de síntese de peptídeos, adicione cinco mililitros de DMF aos 0,25 mililitros de resina de 2 cloro.
Coloque a tampa de volta, agite suavemente o recipiente por 15 segundos e, em seguida, drene-a em uma barra de ferro. Repita a lavagem do DMF mais duas vezes. Em seguida, adicione cinco mililitros de DCM ao vaso, coloque a tampa de volta, agite suavemente o vaso por 15 segundos e, em seguida, drene-o em uma barra de ferro.
Repita a lavagem do DCM mais duas vezes e repita a lavagem do DMF mais três vezes. Em seguida, adicione seis mililitros de concentração de 50% de volume de DMF sobre DCM para inchar a resina por 30 minutos e depois drená-la. Agora transfira seis mililitros de 5% de concentração de volume de hidrazina e DMF para o vaso de reação.
Coloque-o no shaker a 120 RPM e 30 graus celsius por 30 minutos e, em seguida, drene a solução por bomba de vácuo. Para purificar o derivado de hidrazina de um peptídeo Fc-III, use o sistema HPLC para purificar o peptídeo por uma elução de alusão de gradiente de 30 minutos a uma taxa de fluxo de um mililitro por minuto. Após a purificação da proteína de acordo com o manuscrito, adicione em um novo tubo dois mililitros de um miligrama por milliliter SUMO proteína marcada, um mililitro de protease SUMO, um mililitro de tampão protease 10X SUMO, e seis mililitros de água dupla destilada para preparar a solução de reação.
Incubar a mistura por 12 a 16 horas a quatro graus celsius. Em seguida, aliquot a mistura em oito tubos Eppendorf de 1,5 mililitro, e centrifugar a mistura a 15.000 vezes G por 10 minutos a quatro graus celsius. Use uma pipeta para descartar os agregados na parte inferior, em seguida, para os 10 mililitros limpos supernantes, adicione 0,5 mililitros do chorume de contas NTA de 50% de níquel em 50 mililitros PBS.
Coloque o tubo em um agitador rotativo a 200 RPM e quatro graus celsius para misturar suavemente por 60 minutos. Em seguida, carregue a lisade e a mistura de níquel NTA em uma coluna com a tampa inferior da tomada. Remova a tampa inferior e salve o fluxo através de um tubo de centrífuga de 15 mililitros.
A proteína HIS TAG SUMO está se ligando à coluna. A parte do antígeno de ligação, que começa com a CEI para reação de ligadura química nativa, está no fluxo. Agora peso 1,8 miligramas de derivado de hidrazina de um peptídeo Fc-III em um tubo Eppendorf de dois mililitros e adicione 0,8 mililitros de seis cloreto de guanidinium molar em 0,2 solução de fosfato de molar em pH 3.
Vórtice para dissolver o pó. Depois de centrifuging o tubo a 7,200 vezes G por um minuto em temperatura ambiente transfira o supernante para um novo tubo. Adicione uma barra de mexida no tubo e coloque o tubo em um banho de sal de gelo em um agitador magnético para agitar suavemente a solução por 15 minutos.
Em seguida, adicione 40 microlitres de 0,5 nitrito de sódio molar à solução para oxidar o grupo hidrazina. Agitar suavemente a solução por mais 15 minutos no banho de sal gelado. Pesar em 11 miligramas da parte de antígeno purificado e congelador do HPLC, e 13,6 miligramas de MPAA no tubo de reação no banho de sal gelado.
Mexa por cinco minutos e depois ajuste o valor do pH para 6,8 a 7,0 no quarto temperado com seis hidróxido de sódio molar. O passo mais crítico para a ligadura química nativa é ajustar cuidadosamente o valor do pH para iniciar a reação de ligadura. Após 12 horas no banho de sal gelado, adicione 0,4 mililitros de solução neutra de 0,1 molar TCEP ao sistema de reação e mexa por 20 minutos para terminar a reação.
Após centrifugação e purificação do HPLC, obtenha o pico conjugado III para dessulfurização. Dissolva-o em 50 microlitadores de seis cloreto de guanidinium molar em 0,2 solução de fosfato de monossódico molar. Em seguida, adicione 50 microliters de um MOLAR TCEP, 10 microliters de tert-Butylthiol, e cinco microliters de 0,1 molar VAO para quatro soluções.
Ajuste o pH final da solução para 6.9 e mantenha a solução a 37 graus celsius em um shaker por cerca de cinco horas. Centrifugar e purificar novamente. Dissolva o peptídeo preparado em 200 microliters de 32 mililitros de prata e, em seguida, mexa a mistura de reação à temperatura ambiente por quatro horas.
Para converter os tioolados prateados em peptídeos em tiols livres, adicione três microliters de um molar DTT em seis cloreto de guanidinium molar, e 0,2 fosfato de molar monossódico no pH 7. Opere o espectrômetro de massa no modo de varredura completo e ajuste a faixa m/z em 300 a 2.000 e resolução em 60.000. Abra os dados do espectro de massa e encontre os picos do produto em cada etapa para confirmar que a reação química é realizada com sucesso.
Para realizar o ensaio ELISA da interação entre anticorpo DCAF1 e 4G2, cubra cada poço de uma placa de microtâmetro de 96 poços com um picomole de anticorpo anti-GST em 100 microliters de tampão de revestimento. Sele a placa com fitas de vedação e incuba-a a 4 graus celsius durante a noite em um shaker. No bloco da manhã cada poço com 200 microliters de 1%BSA e PBS.
Sele a placa e incubar a sala temperada por uma hora em um shaker. Em seguida, use PBS com 0,05%Tween 20 para lavar cada poço quatro vezes. Neste protocolo, utilizou-se o método de ligadura química nativa para a semisíntese da molécula DCAF1.
O espectro de massa mostra que a molécula dcaf1 final tem uma pesagem molecular desconvolucional de 11.053. Durante o ensaio ELISA, o peptídeo de antígeno Fc-III e DCAF1 inibem competitivamente a ligação de anticorpos 4G2. Tanto o peptídeo de antígeno quanto o DCAF1 bloquearam significativamente a ligação 4G2, enquanto o peptite Fc-III não afetou a interação com anticorpos de antígeno.
Após esse desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para uma intervenção de doenças prejudiciais associadas a anticorpos. Lotes das regiões utilizadas para síntese de peptídeos e ligadura química nativa são altamente tóxicos. Certifique-se de fazer esses experimentos em sua capa química.
