Bu hedeflenen antikor nötralizasyonu ile DCAF molekülleri sentezlemek hakkında anahtar sorulara cevap yardımcı olmak için hizmet edebilir. Bu teknik, DCAF moleküllerinin yüksek verimlilikle sentezlenin en basit yolunu sağlar. Dünya DCAF molekülleri Dang humması ve miyasteni gravis gibi hastalıklar ile ilgili konularda antikor potansiyel müdahaleler var karar.
Bu yöntem, biliş antikorlarını hedeflemek için farklı epitoplara sahip diğer DCAF moleküllerine uygulanabilir. Prosedürü gösteren Xue Bai, benim laboratuvar kıdemli teknisyen olacaktır. 2-Klor reçinesini peptit sentez idrakinin üstünden elde edilen 2-Klor reçinesine dönüştürmek için, 2-Klor reçinesinin 0,25 milimol'una beş mililitre DMF ekleyin.
Kapağı tekrar takla koyun, kabı 15 saniye hafifçe sallayın ve sonra demir bir standa boşaltın. DMF yıkamayı iki kez daha tekrarlayın. Sonra gemiye beş mililitre DCM ekleyin, kapağı tekrar tonuyla tonuyla, kabı 15 saniye hafifçe sallayın ve sonra demir bir standa boşaltın.
DCM yıkamayı iki kez daha tekrarlayın ve dmf yıkamayı üç kez daha tekrarlayın. Daha sonra, 30 dakika boyunca rekarn şişmek ve daha sonra drenaj DCM üzerinde DMF% 50 hacim konsantrasyonu altı mililitre ekleyin. Şimdi reaksiyon kabına hidrazin ve DMF%5 hacim konsantrasyonunun altı mililitresini aktarın.
30 dakika boyunca 120 RPM ve 30 santigrat derece shaker üzerine yerleştirin ve sonra vakum pompası ile çözelti drenaj. Bir Fc-III peptidin hidrazin türevini arındırmak için, dakikada bir mililitre akış hızında 30 dakikalık bir alusion elution ile peptid arındırmak için HPLC sistemini kullanın. El yazmasına göre protein arınması sonra, yeni bir tüp içine mililitre başına bir mililitre mililitre mililitre sumo etiketli protein, bir mililitre SUMO proteaz, bir mililitre 10X SUMO proteaz tamponu ve reaksiyon çözeltisini hazırlamak için altı mililitre çift distile su ekleyin.
Karışımı 12 ila 16 saat boyunca 4 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Sonra sekiz 1.5 mililitre Eppendorf tüpleri içine karışımı aliquot ve santrifüj karışımı 15, 000 kez G 10 dakika için dört derece santigrat. Alttaki agregaları atmak için bir pipet kullanın, sonra 10 mililitre temizlenmiş supernatants içine, 50 milimolar PBS% 50 nikel NTA boncuk bulamaç 0,5 mililitre ekleyin.
Tüpü 200 RPM ve 4 santigrat derecede bir döner çalkalayıcıya yerleştirin ve 60 dakika hafifçe karıştırın. Daha sonra, lisade ve nikel NTA karışımını alt çıkış kapağı olan bir kolona yükleyin. Alt kapağı çıkarın ve 15 mililitrelik bir santrifüj tüp içine akışı kaydedin.
TAG SUMO proteini kolona bağlanır. Yerli kimyasal ligasyon reaksiyonu için BDT ile başlayan bağlayıcı antijen kısmı, akış içindedir. Şimdi ağırlık 1.8 iki mililitre Eppendorf tüp içine bir Fc-III peptid hidrazin türevi miligram ve pH 3 0.2 molar monosodyum fosfat çözeltisi altı molar guanidinium klorür 0.8 mililitre ekleyin.
Girdap tozu eritmek için. 7, 200 kez G'de tüpü santrifüj ettikten sonra oda sıcaklığında bir dakika boyunca supernatant'ı yeni bir tüpe aktarın. Tüp bir karıştırma çubuğu ekleyin ve 15 dakika boyunca nazik bir çözelti ajite için bir manyetik karıştırıcı bir buz tuzu banyosu tüp koyun.
Daha sonra hidrazin grubunu okside etmek için çözeltiye 40 mikrolitre 0,5 molar sodyum nitrit ekleyin. Çözeltiyi buz tuzu banyosunda 15 dakika daha hafifçe çalkalayın. HPLC saflaştırılmış 11 miligram ağırlığında ve dondurulmuş kurutulmuş bağlayıcı antijen parçası, ve 13.6 mpaa miligram buz tuzu banyosunda reaksiyon tüpü içine.
Beş dakika karıştırın ve sonra altı molar sodyum hidroksit ile oda ılıman 6,8-7,0 pH değerini ayarlayın. Yerli kimyasal ligasyon için en kritik adım, ligasyon reaksiyonu başlatmak için dikkatle pH değerini ayarlamaktır. Buz tuzu banyosunda 12 saat kaldıktan sonra reaksiyon sistemine 0,4 mililitre 0,1 molar TCEP nötr çözeltisi ekleyin ve reaksiyonu sonlandırmak için 20 dakika karıştırın.
Santrifüj ve HPLC arınması sonrasında, desülfürizasyon için eşlekap pik III elde edin. 0,2 molar monosodyum fosfat çözeltisi altı molar guanidinium klorür 50 mikrolitre içinde çözün. Sonra bir azı dalgın TCEP 50 mikrolitre ekleyin, tert-Butylthiol 10 mikrolitre, ve dört çözüm için 0.1 molar VAO beş mikrolitre.
Çözeltinin son pH'ını 6,9'a ayarlayın ve çözeltiyi yaklaşık beş saat boyunca bir çalkalayıcıda 37 derecede tutun. Santrifüj ve tekrar arındırMak. Hazırlanan peptiti 200 mikrolitre 32 milimolar gümüş asetat içinde çözün ve ardından reaksiyon karışımını oda sıcaklığında dört saat karıştırın.
Peptid üzerindeki gümüş tiyolleri serbest tiyollere dönüştürmek için, altı molar guanidinium klorür bir molar DTT üç mikrolitre ekleyin, ve 0.2 molar monosodyum fosfat pH 7. Kütle spektrometresini tam tetkik modunda çalıştırın ve m/z aralığını 300-2,000 ve çözünürlüğü 60,000 olarak ayarlayın. Kütle spektrum verilerini açın ve kimyasal reaksiyonun başarıyla gerçekleştirilini doğrulamak için her adımda ürünün tepe noktalarını bulun.
DCAF1 ve 4G2 antikor arasındaki etkileşimE ELISA tayini gerçekleştirmek için, kaplama tampon 100 mikrolitre anti-GST antikor bir picomole ile 96-iyi mikrotiter plaka her iyi kat. Plakayı sızdırmazlık bantlarıyla kapatın ve bir shaker üzerinde bir gecede 4 derecede kuluçkaya yatırın. Sabah blok her iyi ile 200 mikrolitre ile 1% BSA ve PBS.
Plakayı kapatın ve bir shaker üzerinde bir saat boyunca oda ılıman kuluçka. Sonra 0.05% Tween 20 ile PBS kullanın her iyi dört kez yıkamak için. Bu protokolde DCAF1 molekülünün yarı sentezinde yerli kimyasal ligasyon yöntemi kullanılmıştır.
Kütle spektrumu son DCAF1 molekülünün 11, 053 dekonvolutional moleküler ağırlığında olduğunu gösteriyor. ELISA tsödleri sırasında, antijen peptid Fc-III ve DCAF1 rekabetçi 4G2 antikor bağlanmasıini inhibe. Hem antijen peptid hem de DCAF1 4G2 bağlanmasını önemli ölçüde engellerken, Fc-III peptit antijen antikor etkileşimini etkilemedi.
Bu gelişmeden sonra, bu teknik zararlı antikor ilişkili hastalıkların bir müdahale için yol açtı. Peptit sentezi ve doğal kimyasal ligasyon için kullanılan bölgelerin Lot's son derece toksiktir. Kimyasal başlık bu deneyleri almak için emin olun.
