هذا microfluidic نموذج على رقاقة السرطان الذي نسميه معجل التطور، ويوفر منصة يمكن السيطرة عليها على المدى الطويل، في الوقت الحقيقي الدراسات الكمية من ديناميات السرطان ضمن الظروف البيئية المحددة جيدا على مستوى خلية واحدة. التكنولوجيا تسمح لنا للتحقيق في ديناميات التطور من السرطان تحت المشهد الإجهاد مثل الورم. توفير المعلومات بما في ذلك مورفولوجيا، والسكان، والحركة، والهجرة مع مرور الوقت على المستوى الخلوي.
مع القدرة على السيطرة على ورصد سلوك مجموعات الأورام المختلطة تحت التدرجات الإجهاد تسيطر عليها جيدا قد تقدم التكنولوجيا لدينا نموذج أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية لتطوير المخدرات قبل الظهر. ويمكن أيضاً تنفيذ طريقة تغليف الختم الضغطي المعروضة في نظم أخرى من نظم الميكروفويدية التي تتطلب تعديلًا متطورًا في تركيب الغاز المحيط وكذلك قدرة التجربة في المصب. مفاتيح لتنفيذ تجربة طويلة الأجل بنجاح هو تأمين بيئة مستقرة جسديا وبيوكيميائيا.
وينبغي رصد العوامل بما في ذلك درجة الحرارة والرطوبة وتكوين الغاز في جميع الأوقات. للبدء، تلفيق حامل لوحة كافية لعقد أطباق ثقافة الغاز نفاذية في وقت واحد على آلة الطباعة 3D. فك مكونات لوحة عينة ثلاثة مخصصة جيدا مع سائق المسمار.
تطهير المكونات عن طريق التعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة ساعة واحدة على الأقل وترك في بيئة معقمة. لبدء زرع خط الخلية إضافة خمسة ملليلتر من التربسين في كل ثقافة الخلية PC3-Epi أو PC3-EMT في طبق ثقافة 10 سنتيمترا وتشغيل التربسينية لمدة خمس دقائق في حاضنة في 37 درجة مئوية. نقل الخلايا من أطباق الثقافة إلى أنابيب 15 ملليلتر الطرد المركزي ثم الطرد المركزي في 150 مرات ز لمدة ثلاث دقائق.
تجاهل المُندفع. إعادة تعليق كل من الكريات الخلية في أنابيب أجهزة الطرد المركزي 15 ملليلتر وعد خلايا كل PC3-MP أو PC3-EMT باستخدام جهاز قياس الهيموسيت. عزل إجمالي 2.5 مرات 10 إلى أربعة من كل نوع خلية.
اخلط نوعي الخلايا المعزولة ثم أضف في ميليلترين من وسائط الثقافة. بذور مليلترين من ثقافة الخلية في كل من ثلاثة أطباق ثقافة نفاذية الغاز. اترك الغاز قابلًا للنفاذ في الحاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية خلال الليل حتى تعلق الخلايا.
تطهير أجهزة PDMS عن طريق التعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة ساعة واحدة على الأقل وترك في بيئة معقمة. الآن قم بإعداد نظام إمدادات الغاز الذي يتكون من وحدات التحكم في ثاني أكسيد الكربون والأكسجين، ومضخة غاز، وغرفة خلط الغاز، ومرطب أو فقاعة، وثلاث مجموعات منفصلة من صمامات الغاز، ومقاييس الضغط. بدلا من ذلك استخدام نظام إمدادات الغاز الذي يوفر شرط normoxia.
تأكد من زيادة الرطوبة النسبية في غرفة الخلط إلى أعلى من 85٪ إعداد وحدة التحكم الحراري الحضانة على خشبة المسرح في 37 درجة مئوية مع وحدات التدفئة الفرعية منفصلة للغطاء والصحن السفلي. في اليوم التالي تأخذ بها الغاز نفاذية أطباق الثقافة من الحاضنة وتحديد أن المكونات التفصيلية هي في النظام، كل بئر تمتلك حامل صحن ثقافة نفاذية الغاز، حامل رقاقة PDMS، حامل نافذة زجاجية، وزوج من 35 ملليلتر نوافذ زجاجية واسعة. استخدام مسامير المجهزة لتجميع هذه المكونات ومشابك طبق ثقافة نفاذية الغاز.
ثم نقل متوسط الثقافة قبل الدافئة إلى غرفة فراغ إلى إزالة الغاز لمدة 20 دقيقة. علاج رقاقة PDMS في نظام بلازما الأكسجين لمدة 30 ثانية من أجل الحفاظ على الماء. المقبل تحميل اثنين من الحقن ببطء مع 10 ملليلتر من وسائل الإعلام نمو الغاز وغيرها من الحقن مع 10 ملليلتر من كاشف الغاز المطلوب من الفائدة.
على سبيل المثال وسائل الإعلام ووسائل الإعلام مع المخدرات. قم بتوصيل كل حقنة فردية إلى أنابيب 50 سنتيمتر بواسطة إبرة صرف 23 مقياسًا في دبوس فولاذي أجوف واحد. أدخل دبوسًا من الصلب المجوف في الطرف الآخر من الأنبوب.
دفع وسائل الإعلام في الأنابيب إلى رئيس الأنابيب وإدراج دبوس الصلب في كل رقاقة PDMS من خلال طبقة تغطية. ملء طبقة الخزان والرطب طبقة نمط PDMS مع وسائل الإعلام. طبقة الخزان يعمل على رقاقة فقاعة فخ لمنع فقاعات الهواء من الدخول في نمط microfluidic.
ثم تحميل حقنة ملليلتر واحد مع وسائل الإعلام الثقافة. توصيل الحقنة إلى أنابيب خمسة سنتيمترات بواسطة إبرة توزيع قياس 23 في دبوس فولاذي أجوف واحد. إدراج دبوس الصلب جوفاء في الطرف الآخر من الأنابيب ورئيس الأنابيب.
أدخل دبوس الصلب المجوف في فتحة الوسط للرقاقة للحصول على وسائط زائدة يتم استخراجها لاحقًا. تحميل اثنين من الحقن 10 ملليلتر لكل رقاقة في سطح السفينة إلى الأمام ووضع الحقن الأخرى اثنين في سطح السفينة الانسحاب من نظام الحقن. من أجل تجنب محاصرة microbubbles في نمط microfluidic، الاستغناء عن ملليلتر واحد من وسائل الإعلام قبل الدافئة وفك الغاز في طبق ثقافة الغاز العميق 35 ملليلتر نفاذية.
ضع الرقائق مباشرة فوق أغشية الثقافة القابلة للنفاذ للغاز، حيث تقترب الشريحة من السطح السائل بزاوية إمالة 15 درجة. المشبك رقاقة PDMS مع حامل رقاقة PDMS، ودفع جهاز PDMS إلى أسفل. الشريط ورقة من السدادة على رأس جهاز PDMS ومشابك مع حامل رقاقة PDMS، من أجل منع رقاقة من الجفاف.
تعيين معدل تدفق الوسائط حول الصفيف إلى أن تكون 20 ميكرولترات في الساعة. ضع اللوحة بأكملها في حاضنة على خشبة المسرح على خشبة المسرح الآلية من المجهر المقلوب. ربط نظام إمدادات الغاز إلى قنوات الغاز من خلال أنابيب الغاز والحفاظ على ضغط قياس في 0.2 PSI.
هذا يضغط على غشاء استزراع الغاز القابل للنفاذ ضد شريحة PDMS المثبتة لضمان ختم الجهاز. استخراج ببطء وسائل الإعلام المفرطة في رقاقة باستخدام حقنة ملليلتر واحد من ثقب المركز. مراقبة رقاقة تحت المجهر أثناء استخراج وسائل الإعلام ثم التوقف عن استخراج عندما يتم إغلاق الشريحة.
ربط وحدة استشعار درجة الحرارة من الحاضنة على خشبة المسرح إلى لوحة ثلاثة بئر وتعيين إلى 37 درجة مئوية. في هذه الدراسة PC3 مثقف في مسرع تطور دون وجود الإجهاد الخارجي كان منحنيات النمو في حين محاذاة. مما يشير إلى تطابق ملف تعريف انتشار الخلايا كدالة على الموقع عبر الشريحة.
ويكشف الميل الأولي للمنحنيات عن معدل الانتشار. الوقت مضاعفة للخلايا في الجهاز حوالي 24 ساعة. GFP التعبير عن PC3-EMT و mCherry التعبير عن PC3-Epi الخلية اصطف كانت تشارك في الثقافة في مسرع التطور.
بدءا من التقاء 40٪ نمت تربية الأحياء 40٪ التقاء في غضون ثلاثة أيام. في حين أن منحنى النمو من التقاء مجموع هو في شكل نموذج النمو اللوجستية. استمر عدد سكان PC3-EMT في التوسع وتم قمع PC3-Epi في المرحلة غيرmptotic.
كانت خلايا PC3-Epi وPC3-EMT جالسة بكثافة في وسط الجهاز وسمح لهما بالهجرة بحرية نحو المنطقة الفارغة. ويبين الرسم البياني تطبيع سرعة سرعة كلا النمطين الظاهريين سرعة PC3-EMT كانت أعلى بكثير من PC3-Epi بمعامل 1.8 مرات. من المهم جدا تجنب خلق microbubbles في جميع التكاليف في حين ينبغي أن تكون وسائل الإعلام الثقافة قبل الدافئة وفك الغاز.
يجب أن يتم ترتل رقاقة PDMS بشكل صحيح ومعالجتها بلطف. نظرا لطبيعة لينة قابلة للختم لدينا طريقة ختم الضغط يمكن أن تكون preformed العديد من التجارب المصب. مثل استخراج السكان تحت كلينيكي، وتحليل المستقلب المحلي، والتحلل المكاني مناعي وتسلسل.
إن تقنيتنا توضح طريقة لإعادة إنتاج المكونات الرئيسية والتفاعلات في بيئة فائقة الصغر معقدة بطريقة شاملة. ولكن بسيطة بما يكفي لتوفير بيانات كمية وموثوقة وقابلة للاستنساخ.
