نحن نقدم التوسع علم الأمراض، أو ExPath لفترة قصيرة، وهو مقياس منخفض التكلفة لصورة الجزيئات الحيوية من الفائدة في أقسام الأنسجة السريرية القياسية، مع دقة النانو. يتحايل ExPath على حد الانعراج من المجهر الضوئي التقليدي عن طريق غرس قسم الأنسجة السريرية كيميائيًا مع هيدروجيل قابل للانتفاخ بالماء ، ثم توسيع العينات المعالجة بشكل طبيعي وبنسى بنحو مائة ضعف ، مما يسمح بفصل الجزيئات الحيوية المتراكبة مسبقًا وملاحظةها بمجهر بصري تقليدي. يسمح ExPath للمستخدمين بدراسة تكوينات مقياس النانو للجزيئات الحيوية المرتبطة بالأمراض في عينات الأنسجة ، دون الحاجة إلى الاستثمار في أجهزة التصوير الجديدة.
وهكذا ، تمكين رؤى جديدة للمرض وتعزيز التشخيص الجديد. يمكن تطبيق هذه الطريقة على مجموعة واسعة من أنواع الأنسجة واستخدامها لتوفير نظرة جديدة على التسبب في الأمراض المعقدة المختلفة ، مثل السرطان وأمراض الدماغ وأمراض المناعة الذاتية وغيرها. مظاهرة بصرية مهمة لتوضيح كيفية القيام بالخطوات الحاسمة بشكل صحيح، مثل بناء غرفة هلام والتعامل مع عينة هلام قبل وبعد البروتينات K الهضم.
ابدأ بتحويل الأنسجة ذات الأهمية إلى تنسيق متوافق مع ExPath. إذا كان العمل مع العينات السريرية FFPE، وضع الشريحة مع العينة في أنبوب مخروطي 50ml وإضافة 15ml من زيلين. اِكب الأنبوب وضعه أفقياً على شاكر مداري في حوالي 60rpm لمدة ثلاث دقائق.
كرر الغسيل مع 15 مل أخرى من زيلين. ثم غسل الشريحة في سلسلة من المخففات الإيثانول، وفقا لاتجاهات المخطوطات. إذا كان العمل مع الشرائح الملطخة والمثبتة دائمة، وضع كل شريحة في أنبوب مخروطي 50ml، ثم تغطيته مع زيلين.
قم بإزالة زلة الغطاء بعناية بشفرة حلاقة. ثم، معالجة الشريحة بنفس الطريقة التي العينات السريرية FFPE. إذا كان العمل مع الشرائح الأنسجة المجمدة غير المثبتة في حل أكتوبر, إصلاح الأنسجة في الأسيتون في 20 درجة مئوية لمدة عشر دقائق, ثم غسل العينات مع 1X برنامج تلفزيوني حل ثلاث مرات لمدة عشر دقائق لكل غسل.
إذا كانت معالجة العينات السريرية الثابتة والمجمدة سابقًا ، اترك الشرائح لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة لإذابة محلول OTC ، ثم اغسل العينة بـ PBS 1X ثلاث مرات ، لمدة خمس دقائق لكل غسيل. بعد تحويل التنسيق، قم بإجراء استرداد antigen على كافة العينات. سخني 20 ميل Citrate من الملليمولار إلى 100 درجة مئوية في الميكروويف ووضع الشريحة في المحلل.
نقل فورا الحاوية إلى غرفة حضانة واحتضانها عند درجة حرارة 60 درجة مئوية لمدة ثلاثين دقيقة. لطخة العينة، استخدم قلماً مسعوراً لرسم حدود حول قسم الأنسجة على الشريحة. ضع الشريحة في طبق بتري، ثم احتضان الأنسجة مع عازلة منع لمدة ساعة واحدة في 30 درجة مئوية.
ثم، احتضان الأنسجة مع محلول الأجسام المضادة الأولية لمدة ثلاث ساعات على الأقل في درجة حرارة الغرفة أو 37 درجة مئوية. بعد الحضانة، وغسل الأنسجة ثلاث مرات مع العازلة حجب، واحتضان في حل الأجسام المضادة الثانوية لمدة ساعة واحدة على الأقل في درجة حرارة الغرفة، أو 37 درجة مئوية. كرر الغسلات مع العازلة حظر، ثم تنفيذ التصوير الفلورسنت، وذلك باستخدام المجهر مجال واسع التقليدية أو غيرها من نظام التصوير المفضل.
إعداد حل الإرساء وفقًا لتعليمات المخطوطات. وضع الشرائح في طبق بتري 100 مل، pipet محلول الرسو على الأنسجة، واحتضانها لمدة ثلاث ساعات على الأقل في درجة حرارة الغرفة. ثم، إعداد حل هلام وفقا لتوجيهات المخطوطات.
إزالة فائض محلول الرسو من قسم الأنسجة ووضع الشريحة مرة أخرى في طبق بتري. إضافة محلول الجلاج الباردة الطازجة إلى العينة واحتضان الخليط لمدة ثلاثين دقيقة، في أربع درجات مئوية. لبناء غرفة على الشريحة حول العينة، وخلق الفواصل عن طريق قطع رقيقة من الزجاج غطاء بسكين الماس.
تأمين الفواصل على جانبي الأنسجة بالماء ووضع بعناية غطاء الغطاء على الشريحة، مع التأكد من تجنب محاصرة فقاعات الهواء فوق الأنسجة. ثم، احتضان العينة في 37 درجة مئوية في بيئة مرطبة لمدة ساعتين. قم بإزالة غطاء غرفة الهلام عن طريق تمرير شفرة حلاقة بلطف تحت الغطاء ورفعه ببطء عن سطح الجل.
تقليم هلام فارغة حول الأنسجة لتقليل حجم، مع التأكد من خفض هلام غير متناظرة لتتبع الاتجاه. تخفيف البروتين K 1-200 في العازلة الهضم، مع التأكد من إعداد حل ما يكفي لغمر تماما هلام. ثم، احتضان العينة مع الحل في حاوية مغلقة لمدة ثلاث ساعات في 60 درجة مئوية.
إذا لم تنفصل العينة أثناء عملية الهضم، استخدم شفرة حلاقة لإزالة ذلك بلطف. استخدم فرشاة طلاء ناعمة لنقل العينة إلى 1X PBS في حاوية متوافقة مع نظام التصوير المطلوب وكبير بما يكفي لاستيعاب الجل الموسع بالكامل. غسل العينة في برنامج تلفزيوني لمدة عشر دقائق وإذا رغبت في restain مع 300 ملم DAPI.
توسيع العينات عن طريق غسل العينة مع حجم زائد من الماء المقطر مزدوجة ثلاث إلى خمس مرات لمدة عشر دقائق لكل غسل. ثم قم بإجراء التصوير المفلور. إذا تم تنفيذ هذا البروتوكول بنجاح، تظهر العينات كهلام مسطح وشفاف بعد التجانس الميكانيكي ويمكن أن تتوسع بمعامل من 3 إلى 4.5 في الماء.
تم توسيع عينة الكلى FFPE سميكة خمسة ميكرومتر 4.5 مرات، مما أدى إلى قرار من 63 نانومتر باستخدام هدف 0.95 NA. ثم تم تحويل الأنسجة إلى شكل التوسع علم الأمراض متوافقة وملطخة بالأجسام المضادة لألفا أكتينين 4 وفيمينتين، DAPI لتصور الحمض النووي، والقمح Germa Glutenin لتسمية الكربوهيدرات. ثم تم استخدام المجهر القرص الغزل confocal لتصوير العينة.
ثم تم توسيع أنسجة الكلى بالكامل في الماء وصورت مرة أخرى. يمكن أن يكون التصدع والتشوهات وفقدان الأهداف المسماة نتيجة لعدم كفاية الرسو أو التجانس. تم التعامل مع أنسجة الثدي الطبيعية الملطخة بالهماتيوكسيلين واليوسين على أنها عينة من FFPE ، وتم توسيعها ، وتسميتها مع DAPI ، وصورت على مجهر قرص غزلي.
كما تمت معالجة شرائح الكلى غير المثبتة والمجمدة باستخدام هذا البروتوكول. تم إصلاح الأنسجة في الأسيتون البارد وملطخة مع ألفا أكتينين 4، فيمينتين، DAPI، والقمح Germa الغلوتين. عند تنفيذ هذه التقنية، من المهم أن نتذكر توقيت خطوة هلام أمر بالغ الأهمية.
يمكن أن يسبب الهلام المبكر تشوهات، ويحد من التوسع ويؤدي إلى فقدان الجزيئات المستهدفة. بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء التصوير الفلوري على المجهر بعد الهضم والتوسع في العينة. يمكن تطبيق ExPath على نطاق واسع في كل من الأمراض وخارجها.
كما أنه يتيح للباحثين تصور تفاصيل خفية في عينات الأنسجة من الفائدة. ولذلك، فإنه قد يساعد الباحثين على الحصول على رؤى جديدة في التسبب في الأمراض أو آليات العمليات البيولوجية.
