我们提出扩展病理学，或EPath，简言之，一种低成本的测量，以图像生物分子感兴趣的标准临床组织部分，纳米级精度。ExPath 通过化学注入临床组织部分的水膨胀水凝胶，然后物理和均匀地将处理过的样品扩大约一百倍，从而规避传统光显微镜的衍射极限，允许用传统的光学显微镜分离和观察以前重叠的荧光标记生物分子。ExPath 允许用户在组织样本中研究与疾病相关的生物分子的纳米比例配置，而无需投资新的成像硬件。
因此，使新的疾病见解和培养新的诊断。该方法可应用于多种组织类型，并用于对各种复杂疾病（如癌症、脑病、自身免疫性疾病等）的发病机制提供新的见解。视觉演示对于说明如何正确执行关键步骤非常重要，例如凝胶室的构造和蛋白酶 K 消化之前和之后处理凝胶样品。
首先将感兴趣的组织转换为 ExPath 兼容格式。如果使用 FFPE 临床样品，将幻灯片与样品一起放在 50ml 锥形管中，然后加入 15ml 的 Zylene。盖住管子，以大约60rpm的水平放在轨道摇床上三分钟。
再用15毫升的日烯重复洗涤。然后根据手稿指示，在一系列乙醇稀释中清洗幻灯片。如果使用染色和安装的永久滑轨，请将每张幻灯片放在 50 毫升锥形管中，然后用 Zylene 盖住它。
用剃须刀小心地拆下盖滑。然后，以与 FFPE 临床样本相同的方式处理幻灯片。如果使用 OCT 溶液中的未固定冷冻组织幻灯片，在 20 摄氏度下将组织在 20 摄氏度下固定 10 分钟，然后用 1X PBS 溶液清洗样品三次，每次洗涤 10 分钟。
如果处理以前固定的和冷冻的临床样品，在室温下将幻灯片留两分钟以熔化OTC溶液，然后用1X PBS洗涤样品三次，每次洗涤5分钟。格式转换后，对所有样本执行抗原检索。在微波炉中将 20 毫摩尔柠檬酸盐溶液加热至 100 摄氏度，然后将幻灯片放在溶液中。
立即将容器转移到孵化室，并在60摄氏度下孵育30分钟。要弄脏样品，请使用疏水笔在幻灯片上的组织部分周围绘制边界。将幻灯片放在培养皿中，然后在30摄氏度下用阻塞缓冲液孵育组织一小时。
然后，在室温或摄氏37度下用原抗体溶液孵育组织至少三小时。孵育后，用阻断缓冲液洗组织三次，在室温下至少孵育一小时，即37摄氏度。使用阻塞缓冲器重复洗涤，然后使用传统的宽场显微镜或其他首选成像系统进行荧光成像。
根据手稿说明准备锚定解决方案。将幻灯片放在100毫升的培养皿中，将锚定溶液移液在组织上，并在室温下孵育至少3小时。然后，根据手稿说明准备凝胶溶液。
从组织部分去除多余的锚定溶液，然后将幻灯片放回培养皿中。在样品中加入新鲜的冷凝胶溶液，在摄氏四度下孵育混合物30分钟。要围绕样品在幻灯片上构造一个腔室，请用金刚石刀薄切覆盖玻璃片来创建空间。
将空间器放在组织两侧的两侧，并小心地在幻灯片上放置盖玻璃盖，确保避免将气泡困在组织上。然后，在37摄氏度的加湿环境中孵育样品两个小时。轻轻滑动盖玻片下，轻轻将凝胶室的盖子从凝胶表面提起，然后将其从凝胶表面提起。
修剪组织周围的空白凝胶，以尽量减少体积，确保不对称地切割凝胶以跟踪方向。稀释蛋白酶K一到两百在消化缓冲液，确保准备足够的溶液，完全淹没凝胶。然后，在60摄氏度下用溶液在封闭的容器中孵育样品3小时。
如果样品在消化过程中未分离，请使用剃须刀刀片轻轻取出。使用柔软的油漆刷将试样转移到与所需成像系统兼容的容器中的 1X PBS 中，并且足够大，足以容纳完全膨胀的凝胶。在 PBS 中清洗样品 10 分钟，如果需要，请用 300 毫摩尔 DAPI 进行洗涤。
通过用过量的双蒸馏水洗涤样品来扩大样品，每次洗涤时间为 10 分钟。用双蒸馏水进行三到五次清洗。然后，进行荧光成像。如果此协议执行成功，样品在机械均质后显示为扁平透明凝胶，在水中可膨胀 3 到 4.5。
五微米厚的FFPE肾样被扩大4.5倍，结果分辨率为63纳米，使用0.95 NA目标。然后，组织被转换成扩张病理学兼容格式，并染色的抗体阿尔法阿平辛4和维门丁，DAPI可视化核DNA，小麦格玛麸质素标签碳水化合物。然后，旋转圆盘共微显微镜用于成像标本。
肾脏组织然后完全膨胀在水中，并再次成像。标记目标的开裂、变形和丢失可能是锚定或均质不充分的结果。赤氧树脂和 eosin 染色正常乳房组织被视为 FFPE 样本，展开，标有 DAPI，并在旋转的光盘共合显微镜上成像。
未固定和冷冻的肾脏切片也使用该协议进行处理。组织固定在冷丙酮中，并染有阿尔法·阿皮宁4、维门丁、DAPI和小麦格玛·麸质素。执行此技术时，重要的是要记住凝胶步骤的计时至关重要。
过早凝胶会导致变形、限制膨胀并导致目标分子的丢失。按照此程序，在消化和膨胀样品后，可以在显微镜上进行荧光成像。ExPath 可广泛应用于病理学和其他方面。
因为它使研究人员能够直观地看到感兴趣的组织样本中的微妙细节。因此，它可以帮助研究人员获得新的见解，疾病的发病机制或生物过程的机制。
