Presentiamo la patologia di espansione, o ExPath in breve, una misura a basso costo per l'immagine di biomolecole di interesse nelle sezioni di tessuto clinico standard, con precisione su scala nanometrica. ExPath aggira il limite di diffrazione della microscopia ottica convenzionale infondendo chimicamente la sezione del tessuto clinico con un idrogel gonfiabile ad acqua, quindi espandendo fisicamente e uniformemente i campioni trattati di circa un centinaio di volte, consentendo di separare e osservare biomolecole precedentemente sovrapposte etichettate fluorescentmente con un microscopio ottico convenzionale. ExPath consente agli utenti di studiare configurazioni su scala nanometrica di biomolecole correlate alle malattie in campioni di tessuto, senza dover investire in nuovi hardware di imaging.
Pertanto, consentendo nuove intuizioni della malattia e promuovendo nuove diagnosi. Questo metodo può essere applicato a una vasta gamma di tipi di tessuti ed essere utilizzato per fornire nuove informazioni sulla patogenesi di varie malattie complesse, come il cancro, le malattie cerebrali, le malattie autoimmuni e altre. La dimostrazione visiva è importante per illustrare come eseguire correttamente i passaggi critici, come la costruzione della camera di gelatura e la manipolazione del campione gelato prima e dopo la digestione proteinasi K.
Iniziare convertendo il tessuto di interesse in un formato compatibile con ExPath. Se si lavora con campioni clinici FFPE, posizionare lo scivolo con il campione in un tubo conico da 50 ml e aggiungere 15 ml di Zylene. Cappuccio il tubo e posizionarlo orizzontalmente su uno shaker orbitale a circa 60 giri/min per tre minuti.
Ripetere il lavaggio con altri 15 ml di Zylene. Quindi lavare lo scivolo in una serie di diluizioni di etanolo, secondo le indicazioni manoscritte. Se si lavora con diapositive permanenti macchiate e montate, posizionare ogni diapositiva in un tubo conico da 50 ml, quindi coprirlo con Zylene.
Rimuovere con cura il coperchio scivolare con una lama di rasoio. Quindi, elaborare la diapositiva allo stesso modo dei campioni clinici FFPE. Se si lavora con vetrini di tessuto congelato non fissi in soluzione OCT, fissare il tessuto in acetone a 20 gradi Celsius per dieci minuti, quindi lavare i campioni con soluzione 1X PBS tre volte per dieci minuti per lavaggio.
Se si elaborano campioni clinici precedentemente fissati e congelati, lasciare le diapositive per due minuti a temperatura ambiente per sciogliere la soluzione OTC, quindi lavare il campione con 1X PBS tre volte, per cinque minuti per lavaggio. Dopo la conversione del formato, eseguire il recupero dell'antigene su tutti i campioni. Riscaldare la soluzione di citrato millimolare a 100 gradi Celsius in un forno a microonde e posizionare lo scivolo nella soluzione.
Trasferire immediatamente il contenitore in una camera di incubazione e incubarlo a 60 gradi Celsius per trenta minuti. Per macchiare il campione, utilizzare una penna idrofobica per disegnare un limite intorno alla sezione tissutale sullo scivolo. Posizionare lo scivolo in una piastra di Petri, quindi incubare il tessuto con tampone di blocco per un'ora a 30 gradi Celsius.
Quindi, incubare i tessuti con la soluzione di anticorpi primari per almeno tre ore a temperatura ambiente o 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, lavare il tessuto tre volte con tampone di blocco e incubarlo in soluzione anticorpale secondaria per almeno un'ora a temperatura ambiente o 37 gradi Celsius. Ripetere i lavaggi con il tampone di blocco, quindi eseguire immagini fluorescenti, utilizzando un microscopio convenzionale a campo largo o un altro sistema di imaging preferito.
Preparare la soluzione di ancoraggio secondo le istruzioni del manoscritto. Posizionare i vetrini in una piastra di petri da 100 ml, pipeggiare la soluzione di ancoraggio sul tessuto e incubarli per almeno tre ore a temperatura ambiente. Quindi, preparare la soluzione di gelatura secondo le indicazioni manoscritte.
Rimuovere la soluzione di ancoraggio in eccesso dalla sezione tissutale e riposizionare lo scivolo nella piastra di Petri. Aggiungere una soluzione fresca di gelatura a freddo al campione e incubare la miscela per trenta minuti, a quattro gradi Celsius. Per costruire una camera sullo scivolo attorno al campione, create distanziale tagliando sottilmente pezzi di vetro di copertura con un coltello a diamante.
Fissare i distanziati su entrambi i lati del tessuto con acqua e posizionare con cura un coperchio in vetroresina sullo scivolo, assicurandosi di evitare di intrappolare bolle d'aria sul tessuto. Quindi, incubare il campione a 37 gradi Celsius in un ambiente umidificato per due ore. Rimuovere il coperchio della camera di gelatura facendo scorrere delicatamente una lama di rasoio sotto il coverslip e sollevandolo lentamente dalla superficie del gel.
Tagliare il gel vuoto intorno al tessuto per ridurre al minimo il volume, assicurandosi di tagliare il gel in modo asimmetrico per tenere traccia dell'orientamento. Diluire la proteinasi K da uno a duecento nel tampone di digestione, assicurandosi di preparare una soluzione sufficiente per immergere completamente il gel. Quindi, incubare il campione con la soluzione in un contenitore chiuso per tre ore a 60 gradi Celsius.
Se il campione non si stacca durante la digestione, utilizzare una lama di rasoio per rimuoverlo delicatamente. Utilizzare un pennello morbido per trasferire il campione in 1X PBS in un contenitore compatibile con il sistema di imaging desiderato e abbastanza grande da ospitare il gel completamente espanso. Lavare il campione in PBS per dieci minuti e, se lo si desidera, restain esso con DAPI da 300 millimolare.
Espandere i campioni lavando il campione con un volume in eccesso di acqua distillata doppia da tre a cinque volte per dieci minuti per lavaggio. Quindi, eseguire l'imaging a fluorescenza. Se questo protocollo viene eseguito correttamente, i campioni appaiono come un gel piatto e trasparente dopo l'omogeneizzazione meccanica e possono espandersi di un fattore da 3 a 4,5 in acqua.
Un campione di rene FFPE spesso cinque micrometri è stato espanso 4,5 volte, il che ha portato a una risoluzione di 63 nanometri usando un obiettivo 0,95 NA. Il tessuto è stato poi convertito in un formato compatibile con la patologia di espansione e macchiato con anticorpi per Alpha Actinin 4 e Vimentin, DAPI per visualizzare il DNA nucleare e Wheat Germa Glutenin per etichettare i carboidrati. La microscopia confocale a disco rotante è stata quindi utilizzata per l'immagine del campione.
Il tessuto renale è stato quindi completamente espanso in acqua e nuovamente immaginato. Fessurazioni, distorsioni e perdita di destinazioni etichettate possono essere il risultato di un ancoraggio o di un'omogeneizzazione inadeguati. Il tessuto mammario normale macchiato di ematossilina ed eosina è stato trattato come un campione FFPE, espanso, etichettato con DAPI e immaginato su un microscopio confocale a disco rotante.
Anche le fette renali non appolate e congelate sono state elaborate utilizzando questo protocollo. Il tessuto è stato fissato in acetone freddo e macchiato con Alfa Actinin 4, Vimentin, DAPI e Wheat Germa Glutenin. Quando si esegue questa tecnica, è importante ricordare che la tempistica della fase di gelazione è fondamentale.
La gelazione prematura può causare distorsioni, limitare l'espansione e causare la perdita di molecole bersaglio. Seguendo questa procedura, l'imaging fluorescente può essere eseguito al microscopio dopo la digestione e l'espansione del campione. ExPath può essere applicato ampiamente sia nelle patologie che oltre.
In quanto consente ai ricercatori di visualizzare dettagli sottili nei campioni di tessuto di interesse. Pertanto, può aiutare i ricercatori a ottenere nuove intuizioni sulla patogenesi di malattie o meccanismi dei processi biologici.
