אנו מציגים פתולוגיית הרחבה, או ExPath בקיצור, מדד בעלות נמוכה כדי תמונה biomolecule של עניין בסעיפים רקמה קלינית סטנדרטית, עם דיוק ננומטרי. ExPath עוקף את מגבלת עקיפה של מיקרוסקופ אור קונבנציונאלי על ידי החדרה כימית של סעיף הרקמה הקלינית עם הידרוג'ל מתנפח מים, ולאחר מכן הרחבת פיזית ושוויונית את הדגימות שטופלו על ידי כמאה פעמים, המאפשר בעבר חופפים biomolecules שכותרתו בעבר להיות מופרדים ונצפים עם מיקרוסקופ אופטי קונבנציונלי. ExPath מאפשר למשתמשים ללמוד תצורות בקנה מידה ננו של biomolecules הקשורות למחלות בדגימות רקמה, ללא צורך להשקיע בחומרת הדמיה חדשה.
כך, מתן תובנות חדשות של המחלה ו טיפוח אבחון חדש. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של סוגי רקמות ו לשמש כדי לספק תובנה חדשה על הפתוגנזה של מחלות מורכבות שונות, כגון סרטן, מחלות מוח, מחלות אוטואימוניות, ואחרים. הדגמה חזותית חשובה כדי להמחיש כיצד לעשות את הצעדים הקריטיים כראוי, כגון בניית תא geling וטיפול מדגם gelled לפני ואחרי Proteinase K עיכול.
התחל בהמרת רקמת העניין לתבנית תואמת ExPath. אם עובדים עם דגימות קליניות FFPE, למקם את השקופית עם המדגם בצינור חרוט 50 מ"ל ולהוסיף 15 מ"ל של Zylene. מכסים את הצינור ומ מניחים אותו אופקית על שייקר מסלולית בערך 60 סל"ד במשך שלוש דקות.
חזור על הכביסה עם עוד 15 מ"ל של Zylene. לאחר מכן לשטוף את המגלשה בסדרה של דילול אתנול, על פי הוראות כתב היד. אם עובדים עם שקופיות קבועות מוכתמות ומוצבות, מניחים כל שקופית בצינור חרוטי של 50 מ"ל, ואז מכסים אותו עם Zylene.
הסר בזהירות את החלקת המכסה באמצעות סכין גילוח. לאחר מכן, לעבד את השקופית באותו אופן כמו דגימות קליניות FFPE. אם עובדים עם שקופיות רקמה קפואה לא מפויסות בתתא OCT, לתקן את הרקמה אצטון ב 20 מעלות צלזיוס במשך עשר דקות, ולאחר מכן לשטוף את הדגימות עם פתרון PBS 1X שלוש פעמים במשך עשר דקות לכל לשטוף.
אם עיבוד דגימות קליניות קבועות וקפואות בעבר, להשאיר את השקופיות במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר כדי להמיס את פתרון OTC, ולאחר מכן לשטוף את המדגם עם 1X PBS שלוש פעמים, במשך חמש דקות לכל לשטוף. לאחר המרת תבנית, בצע אחזור אנטיגן על כל הדגימות. מחממים 20 מילימולר פתרון ציטראט ל 100 מעלות צלזיוס במיקרוגל וממקמים את השקופית בתסרון.
מעבירים מיד את המיכל לתא דגירה ומדרים אותו ב-60 מעלות צלזיוס למשך שלושים דקות. כדי להכתים את הדגימה, השתמש בעט הידרופובי כדי לצייר גבול סביב קטע הרקמה בשקופית. מניחים את השקופית בצלחת פטרי, ולאחר מכן להחריג את הרקמה עם חיץ חסימה במשך שעה אחת ב 30 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, הדגירה את הרקמות עם פתרון הנוגדן העיקרי לפחות שלוש שעות בטמפרטורת החדר או 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, לשטוף את הרקמה שלוש פעמים עם חיץ חסימה, ו דגירה אותו בתתברית נוגדנים משנית לפחות שעה אחת בטמפרטורת החדר, או 37 מעלות צלזיוס. חזור על השטיפה עם מאגר החסימה ולאחר מכן בצע הדמיה פלואורסצנטית, באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב קונבנציונלי או מערכת הדמיה אחרת של בחירה.
הכינו פתרון עיגון בהתאם להוראות כתב היד. מניחים את השקופיות בצלחת פטרי 100 מ"ל, צינור פתרון עיגון על הרקמה, ו דגירה אותם לפחות שלוש שעות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הכינו פתרון ג'ל לפי הוראות כתב היד.
הסר פתרון עיגון עודף מסעיף הרקמה והחזר את השקופית בחזרה לצלחת פטרי. מוסיפים לדגימה ג'ל קר טרי ומדגרים את התערובת במשך שלושים דקות, בארבע מעלות צלזיוס. כדי לבנות תא על המחוון סביב המדגם, ליצור רווחים על ידי חיתוך דק חתיכות של זכוכית כיסוי עם סכין יהלום.
אבטחו את המהמרים משני צדי הרקמה במים והצבו בזהירות מכסה כיסוי מעל המגלשה, ודאגו להימנע מלכידת בועות אוויר מעל הרקמה. לאחר מכן, הדגירה את המדגם ב 37 מעלות צלזיוס בסביבה לחה במשך שעתיים. הסר את המכסה של תא הג'ל על ידי החלקה עדין של סכין גילוח מתחת לכיסוי והרמתו באיטיות מעל משטח הג'ל.
חותכים את הג'ל הריק סביב הרקמה כדי למזער את עוצמת הקול, הקפד לחתוך את הג'ל באופן סימטרי כדי לעקוב אחר הכיוון. לדלל Proteinase K אחד עד מאתיים במאגר העיכול, הקפד להכין פתרון מספיק כדי להטביע לחלוטין את הג'ל. לאחר מכן, הדגירה את המדגם עם הפתרון במיכל סגור במשך שלוש שעות ב 60 מעלות צלזיוס.
אם הדגימה אינה מתנתתת במהלך העיכול, השתמש בסכין גילוח כדי להסיר אותה בעדינות. השתמש במברשת צבע רכה כדי להעביר את הדגימה ל- PBS 1X במיכל התואם למערכת ההדמיה הרצויה וגדול מספיק כדי להכיל את הג'ל המורחב במלואו. לשטוף את המדגם PBS במשך עשר דקות ואם הרצוי restain אותו עם DAPI 300 מילימולר.
הרחב את הדגימות על ידי שטיפת המדגם עם נפח עודף של מים מזוקקים כפולים שלוש עד חמש פעמים במשך עשר דקות לשטוף. לאחר מכן, בצע הדמיית פלואורסצנטיות. אם פרוטוקול זה מבוצע בהצלחה, דגימות מופיעות כג'ל שטוח ושקוף לאחר הומוגניזציה מכנית והוא יכול להתרחב על ידי גורם של 3 עד 4.5 במים.
דגימת כליות FFPE עבה של חמישה מיקרומטר הורחבה פי 4.5, מה שגרם לרזולוציה של 63 ננומטר באמצעות מטרה של 0.95 NA. הרקמה הוסבה אז לפורמט תואם פתולוגיה של הרחבה ומוכתמת בנוגדנים לאלפא אקטין 4 ווימנטין, DAPI כדי לדמיין דנ"א גרעיני, וחיטה ג'רמה גלוטנין לתיוג פחמימות. לאחר מכן נעשה שימוש במיקרוסקופיית קונפוקל של דיסק מסתובב כדי לדמיין את הדגימה.
רקמת הכליה הורחבה אז באופן מלא במים ותמונה שוב. פיצוח, עיוותים ואובדן יעדים מסומנים יכולים להיות תוצאה של עיגון לקוי או הומוגניזציה. המטוקסילין ואאוסין מוכתמים רקמת שד נורמלית טופלה כדגימה FFPE, מורחב, שכותרתו עם DAPI, ותמונה על מיקרוסקופ קונפוקל דיסק מסתובב.
פרוסות כליה לא מעובדות וקפואות עובדו גם הן באמצעות פרוטוקול זה. הרקמה תוקנה באצטון קר מוכתם אלפא Actinin 4, וימנטין, DAPI, חיטה Germa גלוטנין. בעת ביצוע טכניקה זו, חשוב לזכור את העיתוי של שלב gelation הוא קריטי.
ג'לציה מוקדמת עלולה לגרום לעיוותים, להגביל את ההתפשטות ולגרום לאובדן מולקולות מטרה. בעקבות הליך זה, הדמיה פלואורסצנטי יכול להתבצע על מיקרוסקופ לאחר עיכול והרחבת המדגם. ExPath ניתן ליישם באופן נרחב הן פתולוגיות ומעבר.
כפי שהוא מאפשר לחוקרים לדמיין פרטים עדינים בדגימות הרקמה של עניין. לכן, זה עשוי לעזור לחוקרים לקבל תובנות חדשות בפתוגנזה של מחלות או מנגנונים של תהליכים ביולוגיים.
