تطوير الجينات الانتقائية وأدوات تسليم المخدرات لعلاج الاضطرابات العصبية، يتطلب تحديد كم وتوصيف استهداف الخلايا، عند إعادة الإدارة، أو ناقلات الفيروسية، أو الجسيمات النانوية. لديهم القدرة على الإنتاجية ومتعددة من تدفق القياس الخلوي، ويسمح لتحديد مباشرة وفي وقت واحد من أنواع الخلايا المتعددة من الدماغ الماوس والحبل الشوكي. وسوف يكون إثبات الإجراء فرانسيسكو خافيير مولينا استيفيز، وهو ما بعد الدكتوراه من مختبر الكسندر.
بعد حصاد الدماغ والحبل الشوكي من فأر C57 Black 6 البالغ من العمر ثمانية أسابيع ، ضع الأنسجة في آبار فردية لطبقة من ستة آبار ، تحتوي على ملليلترين من الجليد البارد HPSS لكل بئر على الجليد. تقسيم كل الأنسجة المحصودة إلى قطعتين متساويتين. واستخدام مقص ل mince نصف عينة كل نسيج في قطعة سميكة ملليمتر واحد إلى اثنين.
عندما تم تفتيت جميع الأنسجة، قبل شطف 1، 000 ميكرولتر ماص تلميح في HPSS، واستخدام ماصة لنقل كل تعليق الأنسجة إلى أنابيب مخروطية 15 ملليلتر الفردية. شطف الآبار مع ملليلتر اثنين إضافية من HPSS في البئر. وسحب يغسل في الأنابيب المخروطية 15 ملليلتر المقابلة.
رواسب العينات عن طريق الطرد المركزي. وخلط 50 ميكرولترات من انزيم P من مجموعة تفكك الأنسجة العصبية مع 1, 900 ميكرولترات من العازلة X من عدة لكل عينة. دافئة مزيج الانزيم في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق على الأقل.
ويُفطّن المُنْتَرَح من كلّ أنبوب جمع الأنسجة. عندما يكون خليط الإنزيم جاهزًا، أضف 1.95 ملليلتر من المحلل لكل عينة. ودوامة بلطف لإعادة تعليق الكريات.
المقبل، احتضان العينات على عجلة لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية، ومزيج 10 ميكرولترات من انزيم A مع 20 ميكرولترات من Y العازلة لكل عينة. Prewarm محلول الانزيم الثاني في 37 درجة مئوية، قبل إضافة 30 ميكرولترات من الحل إلى كل حل الأنسجة في نهاية الحضانة اهتزاز. استخدم 1000 طرف ماصة ميكروليت، مشطف مسبقًا مع HPSS لخلط كل عينة بلطف.
وإرجاع العينات إلى العجلة لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة، اعتقال ردود الفعل الأنزيمية مع 10 ملليلتر من الجليد البارد HPSS. ورواسب العينات عن طريق الطرد المركزي.
في نهاية الطرد المركزي، إعادة تعليق الكريات في سبعة ملليلتر من الجليد البارد HPSS لكل أنبوب. ودوامة بلطف كل عينة، قبل عقد الأنابيب على الجليد. بالنسبة لتجانس الأنسجة، أضف ثلاثة ملليلترات من HPSS المبردة مسبقًا إلى مدفع الهاون الزجاجي المبرد مسبقًا لمطحنة أنسجة الدونسي، ونقل النصف الثاني من عينة واحدة من أنسجة الدماغ أو الحبل الشوكي المقطوعة إلى هاون.
بلطف لطخ الأنسجة مع 10 السكتات الدماغية من Pestle A، تليها 10 السكتات الدماغية من ب. Pestle ونقل خليط متجانس في أنبوب جديد مخروطي 15 ملليلتر. املأ الأنبوب إلى حجم نهائي من 10 ملليلترات مع HPSS المبردة مسبقًا للطرد المركزي. وإعادة تعليق بيليه في سبعة ملليلتر من HPSS الطازجة مع دوامة، قبل عقد العينة على الجليد.
لإزالة الحطام، إضافة ثلاثة ملليلتر من محلول Percoll متساوي التوتر المبردة مسبقاً إلى كل عينة هضمية أو متجانسة. ودوامة بلطف العينات للتأكد من أنها مختلطة متجانسة. المقبل، الطرد المركزي العينات، وإزالة القرص الأبيض بعناية من الحطام والميلين العائمة على سطح المحلل.
عندما تم التخلص من الحطام ، وجمع كل ما عدا 100 ميكرولترات الماضي من عظمى من كل أنبوب دون إزعاج الكريات. إعادة تعليق كل بيليه في ملليلتر واحد من حل BL FACS لنقلها إلى أنابيب 1.5 ملليلتر microcentuge الفردية. بعد هذا التكامل مع حل Percoll، من المهم إزالة القرص الحطام وsupernatant بعناية فائقة دون إزاحة بيليه الخلية لتجنب فقدان العينة.
بعد الطرد المركزي، وpirate بعناية كبرى من كل أنبوب، وإعادة تعليق الكريات في 350 ميكرولترات من FACS BL الطازجة لكل أنبوب. لتحليل تدفق الخلايا الخلوية من أنواع الخلايا المعزولة، احتضان العينات مع خمسة ميكروغرام لكل ملليلتر من كتلة FC لكل أنبوب لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية قبل إضافة الأجسام المضادة المناسبة لكل أنبوب وفقا للبروتوكول الدائمة المبينة في الجدول. دوامة كل أنبوب لمدة خمس ثوان لخلط.
ووضع العينات عند أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة محمية من الضوء. في نهاية الحضانة، وغسل العينات مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني لكل أنبوب، والطرد المركزي. إعادة تعليق الكريات في الحجم المناسب من streptavidin لكل أنبوب.
بعد دوامة لخلط، احتضان العينات لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية محمية من الضوء. وغسل الخلايا مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني لكل أنبوب كما هو موضح. بعد التخلص من super، إعادة تعليق الكريات في 300 ميكرولتر من FACS BL الطازجة لكل أنبوب.
وتسمية كل عينة مع خمسة ميكرولترات من 7-AAD. ثم تخزين العينات في أربع درجات مئوية محمية من الضوء حتى تحليل cytofluorometric. ينتج أسلوب التجانس زيادة غلة الخلايا من كل من الدماغ والحبل الشوكي بشكل عام ، ولكن غالبية الخلايا التي يتم استردادها عادة ما تكون ميتة ، مما يؤدي فقط إلى شفاء حوالي 14 ٪ من الخلايا القابلة للحياة من الدماغ ، وقرابة 10 ٪ تلتئم من الحبل الشوكي.
في المقابل, طريقة الهضم papain النتائج في الحفاظ بشكل أفضل عموما من قابلية البقاء الخلوية. تحليل تعليق خلايا الدماغ والحبل الشوكي مع تسعة لون ثنائي التدفق الخلوي، ويكشف عن وجود CD45 + CD11b + microglia، و الضامة. و CD45+CD11b-اللمفاويات في كلا النسيجين.
ويمكن بعد ذلك التمييز بين مجموعات الخلايا CD45 وفقاً لإيجابيتها بالنسبة للعلامات الفلكية، أو علامات القلة oligodendrocyte، أو تعبير علامة السطح الوحشية والبطانية. باستخدام طريقة التجانس، ما بين 32 إلى 38٪ من الخلايا القابلة للحياة هي من أصل دموي. في حين أن طريقة الهضم الأنزيمية النتائج في الحصول على جزء كبير جدا من خلايا CD45-غير مكون للدم.
من اللافت للنظر أن CD45+CD11b+microglia و الضامة تمثل الكسر الخلية الأكثر وفرة قابلة للحياة مع طريقة التجانس. طريقة الهضم، ومع ذلك، تنتج تمثيل أكثر التجانس من أنواع الخلايا بما في ذلك الخلايا الفلكية، oligodendrocytes، الخلايا البطانية، والخلايا العصبية. هذا البروتوكول متعدد الاستخدامات، ويمكن استغلاله لعدة تطبيقات في المصب مثل القياس الكمي أو عزل الخلايا الفرعية المحددة، أو الثقافة الأولية، أو الكيمياء الحيوية، أو تحليل تسلسل الحمض النووي الريبي.
لقد نفذنا هذا البروتوكول لتقييم التعبير الجيني والتوقيعات الوظيفية لمختلف سكان الجهاز العصبي المركزي أثناء هذا التقدم، أو بعد العلاج في نموذج فأر من التصلب الجانبي داخل الغدد.
