يمكن أن يؤدي فصل كميات صغيرة من الأنسجة العصبية بنجاح إلى تجهيز المختبرات للحصول على نظرة ثاقبة خاصة بالبنية حول فعالية العلاج ، والوظيفة الخلوية ، بالإضافة إلى آليات عمل المرض والعلاج. ينتج عن بروتوكول التفكك العصبي هذا باستمرار تعليق خلية واحدة قابل للتطبيق وفعال للغاية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكننا معالجة العينات التي ليست سوى جزء صغير من تلك التي تهدف إليها المجموعات التجارية.
التخطيط السليم والإعداد هما مفتاح تحقيق نتيجة ناجحة لهذه التقنية. سيكون من المفيد إجراء العديد من جولات التدريب للتعرف على البروتوكول. بعد تخدير أنثى C57BL/6J البالغة من العمر ستة أشهر ، اضغط على أسفل البطن وارفع الجلد باستخدام الملقط.
ثم باستخدام مقص ، قطع من خلال الفراء والجلد إلى أسفل القفص الصدري. قم بعمل شقين قطريين يبدآن أسفل القفص الصدري ويتحركان نحو كل كتف. ثم استئصال الحجاب الحاجز والقفص الصدري بعناية لفضح القلب.
بعد إزالة أي نسيج ضام حول القلب بعناية ، استخدم المقص لقص الأذين الأيمن. ثم قم بإيقاف تدفق الأيزوفلوران إلى التنفس. عقد القلب ثابت مع ملقط ومع شطبة إبرة فراشة متجهة لأعلى ، اخترق البطين الأيسر مع الحفاظ على مستوى الإبرة وموازية للحيوان.
بعد ذلك ، قم بتثبيت الإبرة في مكانها ، وقم بتشغيل المضخة وقم بتدوير ما لا يقل عن 30 ملليلتر من المحلول الملحي أو الهيبارين حتى يصبح السائل الذي يغادر القلب غير شفاف ويكون لون الكبد والرئتين شاحبا. بعد التروية ، قم بإيقاف تشغيل المضخة ، وإزالة الإبرة ، ونقل الماوس إلى منطقة التشريح. بعد قطع الرأس ، اقطع الفراء من الجزء الخلفي من الرأس حتى العينين وقشر الجلد مرة أخرى لفضح الجمجمة.
بعد ذلك ، قم بقص الجمجمة بين العينين وقم بإجراء قطعتين في الجزء الخلفي من الجمجمة في وضعيتي الساعة 10 و 2. ثم قم بعمل قطع طويل واحد على طول الخط السهمي الأوسط للجمجمة إلى القطع الأصلي بين العينين. بعد ذلك ، باستخدام الملقط ، قشر نصفي الجمجمة بعيدا إلى الجانبين.
ثم استخدم ملعقة لإزالة الدماغ ووضعها في طبق بتري زجاجي 60 ملم مملوء ب DPBS البارد والاحتفاظ به على الجليد. باستخدام مشرط أو ماكينة حلاقة ، افصل كل نصف كرة وأزل المصابيح الشمية والمخيخ. ثم قم بإزالة الدماغ الأوسط حتى يتعرض الحصين.
بعد ذلك ، قم بتأمين الدماغ باستخدام الملقط. ثم باستخدام مجموعة ثانية من الملقط ، قم بمضايقة الحصين بلطف من كل نصف الكرة الأرضية. انقل كلا من الحصين إلى أنبوب 1.5 ملليلتر يحتوي على DPBS بارد وضع الأنبوب على الجليد.
باستخدام الملقط ، انقل قطع أنسجة الحصين إلى أنبوب C وأضف 30 ميكرولتر من مزيج الإنزيم 2 إلى الأنبوب. بعد لف الغطاء وتشديده حتى ينقر ، ضع الأنبوب في جهاز فصل وقم بتشغيل البرنامج المناسب. أثناء تشغيل البرنامج ، قم قبل تبليل مصفاة خلية 70 ميكرون موضوعة على أنبوب مخروطي 50 ملليلتر مع ملليلترين من المخزن المؤقت BSA.
بعد اكتمال برنامج التفكك ، أضف أربعة ملليلترات من المخزن المؤقت BSA إلى الأنسجة المنفصلة وقم بتصفية الخليط من خلال مصفاة الخلية على الأنبوب المخروطي 50 ملليلتر. بعد ذلك ، أضف 10 ملليلتر من DPBS إلى الأنبوب C. ثم أغلق الأنبوب ، وقم بتدوير المحلول بلطف ، وقم بتصفيته من خلال مصفاة الخلية على الأنبوب المخروطي سعة 50 ملليلتر.
الطرد المركزي تعليق الخلية المصفاة ، والتخلص من supernatant دون إزعاج بيليه وتخزين الكرية. لإزالة الحطام ، أعد تعليق الكريات ب 1،550 ميكرولتر من DPBS البارد ونقل التعليق إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. ثم أضف 450 ميكرولتر من محلول إزالة الحطام البارد وماصة لأعلى ولأسفل.
تراكب تعليق الخلية بلطف مع ملليلتر واحد من DPBS الباردة ، والحفاظ على الطرف ضد جدار الأنبوب المخروطي. كرر الإجراء حتى يكون التراكب الكلي ملليلترين. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للتعليق عند 3،000 مرة G لمدة 10 دقائق مع تسارع كامل واستراحة كاملة.
استنشق الطبقة العليا، ثم امسح طرف الماصة ذهابا وإيابا لاستنشاق الطبقة الوسطى البيضاء. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الطبقة الوسطى دون إزعاج الطبقة السفلية. بعد ذلك ، أضف ملليلترين من DPBS البارد وماصة لأعلى ولأسفل للخلط.
ثم الطرد المركزي للتعليق في 1،000 مرات G لمدة 10 دقائق مع تسارع كامل وكسر كامل. بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الكريات في مخزن مؤقت BSA بملليلتر واحد. بعد عد الخلايا ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية المتبقي وإعادة تعليق الكريات في 50 ميكرولتر من البقعة الميتة الحية المخففة.
ثم انقل العينة إلى أنبوب تدفق ملصق واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 8 إلى 10 دقائق في الظلام. بعد الحضانة ، أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت BSA وكرر خطوة الطرد المركزي. ثم تخلص من السوبرناتانت ، واترك كمية صغيرة من المخزن المؤقت في الأنبوب.
واستبعدت البوابة الرئيسية الحطام في مؤامرات التشتت الأمامي مقابل المؤامرات الجانبية المبعثرة وتم استبعاد الخلايا الميتة لاحقا. استبعدت البوابة الثانية الخلايا الإيجابية لبروتين المايلين الأساسي. ومن الخلايا المتبقية ، تم إنشاء مخططات كثافة للخلايا إيجابية لكل فلوروكروم.
تم حساب تردد كل مجموعة من الخلايا العصبية من البوابة الثالثة. وأسفرت العينات التي عولجت بالتفكك الميكانيكي اليدوي والهضم الأنزيمي عن عدد أقل بكثير من الخلايا ذات الأهمية، في حين أظهرت العينات الجديدة والثابتة التي تمت معالجتها بالتفكك الميكانيكي الآلي والهضم الأنزيمي وجود عدد أكبر بعدة أضعاف من الخلايا ذات الاهتمام. في حين أن خطوات التروية وإزالة الحطام يمكن أن تكون صعبة في البداية ، فإن الحفاظ على يد سلسة وثابتة يمكن أن يساعد في ضمان النجاح.
