This work was supported by NIGMS, National Institutes of Health (GM094623). Significant portions of this work were performed in the Environmental Molecular Sciences Laboratory, a DOE/BER national scientific user facility located at the Pacific Northwest National Laboratory (PNNL). PNNL is operated for the DOE by Battelle under Contract DE-AC05-76RLO1830.

1. إعداد مقدما <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفوسفات العقيمة الدافئة مخزنة المالحة (PBS) إلى 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعديل الدافئ Dulbecco ومتوسطة النسر (DMEM) والحد الأدنى الضروري المتوسطة (MEM) تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS)، و 100 وحدة دولية / مل البنسلين، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين إلى 37 درجة مئوية. ملاحظة: هذه تمثل وسائل الإعلام النمو الطبيعي (NGM) لخلايا RAW وهيلا على التوالي. </li></ol> 2. إعداد الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو الخلايا 264.7 الخام إلى 70-90٪ confluency في NGM. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في ترطيب الهواء 95٪ / 5٪ CO 2 الغلاف الجوي. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو خلايا هيلا إلى 70-90٪ confluency في NGM. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في ترطيب الهواء 95٪ / 5٪ CO 2 الغلاف الجوي. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل جمع، وغسل أحادي الطبقة الخلية مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الخلايا ما قبل متكدسة في أنبوب مخروطي العقيمة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كشط بلطف خلايا RAWمع شرطي المطاط في برنامج تلفزيوني، مع pipetting لالمتكررة لتفريق تجمعات الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل خلايا هيلا مع 0.25٪ محلول التربسين حتى يظهر الفحص البصري التفكك من سطح الثقافة. على سبيل المثال، استخدام 2 إلى 3 مل لT-75 قارورة. ضبط حجم وفقا لذلك لضمان حل التربسين يغطي سطح النمو بأكمله. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إخماد رد فعل التفكك مع NGM تحتوي على 10٪ FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ما لا يقل عن ضعف حجم NGM إلى التربسين، مع pipetting لالمتكررة لتفريق تجمعات الخلية. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه طفيفة الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 900 x ج لمدة 4 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend في نفس الحجم كما حل التربسين / إخماد باستخدام برنامج تلفزيوني العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات أو الجسيمات المضادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه طفيفة الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 900 x ج لمدة 4 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend في حجم كاف من برنامج تلفزيوني لمدة 5.5 × 10 6-6،0 × 10 6 خلية / مل. ملاحظة: على سبيل المثال، واحد T-75 قارورة تسفر approxim¢ الأمر 7.5 × 10 6 خلايا (29). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حافظ على تعليق خلية على الجليد حتى Electroporation لل. </li></ol> 3. إعداد ل electroporation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> cuvettes قبل البرد Electroporation لل(0.4 سم الفجوة) على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على جهاز Electroporation للوتعيين الجهد إلى 0.3 كيلو فولت. ملاحظة: كانت السعة والمقاومة لا إعدادات قابلة للتعديل على موقعنا electroporator (وضعت في 10 μF و 600 Ω من قبل الشركة المصنعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء وحات الانتعاش مع NGM وتتوازن في ترطيب الهواء 95٪ / 5٪ CO 2 الغلاف الجوي عند 37 درجة مئوية. </li></ol> 4. Electroporation لل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 400 ميكرولتر من تعليق خلية في كفيت ما قبل المبردة وإضافة 20 ميكروغرام من البروتين المحدد إلى كوفيت (50 ميكروغرام / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نفض الغبار كفيت بلطف ~ 10 مرات لخلط دون الإضرار الخلايا. ملاحظة: يمكن أيضا كفيت أن مقلوب عدة مرات لتخلط جيدا، ولكن لا الماصة صعودا وهبوطا أو دوامة لتجنب إتلاف الخلايا. </li><lط&gt; خارج الجاف كفيت مع منشفة ورقية أو ممسحة أخرى لتجنب الانحناء الكهربائي في electroporator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينة Electroporate عند 0.3 كيلو فولت ل1،5-1،7 ميللي ثانية. ملاحظة: كان هذا نموذجي لهذه الدراسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة بعد Electroporation للنفض الغبار كفيت بلطف ~ 10 مرات لمزيج دقيق. </li></ol> 5. التصفيحات من الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متجر كفيت مع خلايا electroporated على الجليد حتى جاهزة لوضع لوحات في الانتعاش. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالنسبة لمعظم التحليلات المصب، وغسل الخلايا 1X مع حرارة ما قبل NGM لإزالة البروتين المستجيب دخيلة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الخلايا لتحليل وتعليق في 3-5 مل من NGM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 900 x ج لمدة 4 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend في حجم كاف من NGM لحجم المطلوب لوحة (على سبيل المثال 2 مل لمدة 35 ملم طبق). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة كمية مناسبة من الخلايا لتحليل المصب. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مثال 1: لوحة في أطباق أسفل الزجاج لتحليل المجهري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مثال 2: لوحة كثافة العملياتس البلاستيك زراعة الخلايا لتحليل البروتين مثل التنقيات التقارب. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح للخلايا لاسترداد في لوحات معايرتها في ترطيب الهواء 95٪ / 5٪ CO 2 في الجو 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 4 ساعة. </li></ol> 6. تحليل المجهر 6.1) التثبيت / تلطيخ المناعي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا 1X مع برنامج تلفزيوني العقيمة بعد فترة نقاهة 4 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الخلايا في الميثانول بنسبة 100٪ لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استخدام ما يكفي من الميثانول لتغطية تماما الخلايا (على سبيل المثال 2 مل لمدة 35 ملم طبق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل 3X مع برنامج تلفزيوني العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilize الخلايا مع 0.4٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة. على سبيل المثال، استخدم 1 مل لوحة قطرها 35 ملم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط طول permeabilization وقوة تريتون X-100 وفقا لحاتمة والمكان من البروتين الهدف. ملاحظة: سوف تحتاج أفضل النتائج يتم تحديدها تجريبيا لكل هدف، ولكن ينبغي أن تكون الشروط المذكورة أعلاه كافية لمعظم جأهداف ytosolic. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منع مع 5٪ مصل بقري الزلال (BSA) في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة على RT. على سبيل المثال، استخدم 1 مل لوحة قطرها 35 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل 3X مع برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأجسام المضادة الأولية في الضد حل ملزم (0.1٪ تريتون X-100 و 1٪ BSA في PBS) بين عشية وضحاها في 4 &#160; ° C مع هزاز لطيف. على سبيل المثال، استخدم 0.5 مل لوحة قطرها 35 ملم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع توصيات الشركة الصانعة للأجسام المضادة التخفيف. ملاحظة: على سبيل المثال، تم استخدام ملزم streptavidin العلامة الببتيد (SBP-علامة) الأجسام المضادة في 1: 1،000 التخفيف، في حين تم استخدام الأجسام المضادة PKN1 في 1: 200 التخفيف. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل 4X مع برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان مع الأجسام المضادة المناسبة fluorescently مترافق الثانوية في الضد حل ملزم لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على سبيل المثال، استخدم اليكسا 488 أو 647 اليكسا لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع توصيات الشركة الصانعة للنملةتخفيف ibody. (على سبيل المثال حوالي 1: 1،000 لهذه الدراسة). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة البقع الأخرى حسب الحاجة، على سبيل المثال، 5 ميكرومتر القمح الجرثومية agglutinnin (WGA) مترافق لاليكسا 647 أو دابي وفقا لتوصية الشركة الصانعة، لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل 5X مع برنامج تلفزيوني وتخزينها في 4 درجات مئوية، محمية من الضوء حتى جاهزة للصورة. </li></ol> 6.2) متحد البؤر المجهري وتحليل الصور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات الصورة على مجهر متحد البؤر مقلوب باستخدام الهدف الغمر 63X النفط. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة قناة الخضراء باستخدام سطر 488nm ليزر الأرجون، مع انبعاث عرض النطاق الترددي بين 492-542 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة القناة الحمراء باستخدام 633 نانومتر ليزر ديود، مع انبعاث عرض النطاق الترددي بين 640-718 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة القناة الزرقاء باستخدام 405 نانومتر ليزر ديود، مع انبعاث عرض النطاق الترددي بين 407-453 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضمان القناة متعددة ض مداخن تغطي مجمل حجم الخلوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صور عملية مع المناسبة برامج معالجة الصور. </li></ol> 7. الانجذاب تنقية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا electroporated مرتين مع 4 ° C PBS بعد فترة نقاهة 4 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليز مع ~ 1.0 مل من تحلل العازلة (1٪ تريتون X-100 مع كوكتيل مثبط البروتياز والفوسفاتيز المانع في PBS) على الجليد. استخدام مثبطات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ملاحظة: على سبيل المثال، سواء تم تزويد الفوسفاتيز ومثبطات الأنزيم البروتيني المستخدمة في هذه الدراسة في 100X، ولكن ينبغي الصيغ الأخرى تعمل بشكل جيد على قدم المساواة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كشط فورا الخلايا مع شرطي المطاط وجمع في أنابيب مخروطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليز من قبل vortexing قوية وصوتنة. ملاحظة: طرق تحلل أخرى يمكن أن تعمل بنفس القدر أيضا، ولكن سوف تحتاج الكفاءة يتم تحديدها تجريبيا لمدى ملاءمة متطلبات الفحص. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصوتن 3 × 30 ثانية مع vortexing لفترات متقطعة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 10،000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية لجمعالحطام الخلوي والمجاميع غير قابلة للذوبان. حفظ طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين أحجام متساوية (~ 1.0 مل) من electroporated المحللة زنزانة مع 50 ميكرولتر من Streptavidin الراتنج تعليق الاغاروز في 4 درجات مئوية خلال الليل مع نهاية الإفراط في نهاية التناوب. ملاحظة: هذا الراتنج يلتقط البروتين electroporated (والمجمعات المرتبطة بها) عبر ملزم streptavidin الببتيد العلامة تقارب لها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 2،500 x ج لمدة 2 دقيقة وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل مرتين مع 40 مجلدا السرير (~ 1 مل) PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 30 ميكرولتر 4X LDS العازلة تحميل (141 ملي تريس قاعدة، 2٪ LDS، و 10٪ الجلسرين، 0.51 ملي EDTA، 0.22 ملي SERVA الأزرق G، 0.175 ملي الفينول الأحمر، ودرجة الحموضة 8.5)، و 20 ميكرولتر diH 2 O، و 1 ميكرولتر من 0.5 M تريس (2-carboxyethyl) الفوسفين (TCEP)، والسماح لبعض وحدات التخزين بالبقاء في الخرز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحرارة على 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة وباردة على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور&gt; 10،000 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء طخة غربية باستخدام الأجسام المضادة المناسبة ملاحظة: وإعادة، يتم استخدام المضادة للPKN1 الأجسام المضادة الأولية. </li></ol>

<ol>
	<li>Mota, L. J., Cornelis, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacterial+injection+kit:+type+III+secretion+systems.">The bacterial injection kit: type III secretion systems.</a> Annals of Medicine. 37, 234-249 (2005).</li><li>Galan, J. E., Collmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+III+secretion+machines:+bacterial+devices+for+protein+delivery+into+host+cells.">Type III secretion machines: bacterial devices for protein delivery into host cells.</a> Science. 284, 1322-1328 (1999).</li><li>Hueck, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+III+protein+secretion+systems+in+bacterial+pathogens+of+animals+and+plants.">Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants.</a> Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 62, 379-433 (1998).</li><li>Cornelis, G. R., Van Gijsegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+function+of+type+III+secretory+systems.">Assembly and function of type III secretory systems.</a> Annual Review of Microbiology. 54, 735-774 (2000).</li><li>He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+III+protein+secretion+systems+in+plant+and+animal+pathogenic+bacteria.">Type III protein secretion systems in plant and animal pathogenic bacteria.</a> Annual Review of Phytopathology. 36, 363-392 (1998).</li><li>Dean, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+domains+and+motifs+of+bacterial+type+III+effector+proteins+and+their+roles+in+infection.">Functional domains and motifs of bacterial type III effector proteins and their roles in infection.</a> FEMS Microbiology Reviews. 35, 1100-1125 (2011).</li><li>Espinosa, A., Alfano, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disabling+surveillance:+bacterial+type+III+secretion+system+effectors+that+suppress+innate+immunity.">Disabling surveillance: bacterial type III secretion system effectors that suppress innate immunity.</a> Cellular Microbiology. 6, 1027-1040 (2004).</li><li>Orchard, R. C., Alto, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+GEFs:+a+common+theme+for+bacterial+pathogens.">Mimicking GEFs: a common theme for bacterial pathogens.</a> Cellular Microbiology. 14, 10-18 (2012).</li><li>Galan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+themes+in+the+design+and+function+of+bacterial+effectors.">Common themes in the design and function of bacterial effectors.</a> Cell Host Microbe. 5, 571-579 (2009).</li><li>Ellis, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+ex+vivo/in+vitro+transduction+efficiency+of+mammalian+primary+cells+and+cell+lines+with+Nine+natural+adeno-associated+virus+(AAV1-9)+and+one+engineered+adeno-associated+virus+serotype.">A survey of ex vivo/in vitro transduction efficiency of mammalian primary cells and cell lines with Nine natural adeno-associated virus (AAV1-9) and one engineered adeno-associated virus serotype.</a> Virology Journal. 10, 74 (2013).</li><li>Sreelatha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+effector+protein,+VopQ,+forms+a+lysosomal+gated+channel+that+disrupts+host+ion+homeostasis+and+autophagic+flux.">Vibrio effector protein, VopQ, forms a lysosomal gated channel that disrupts host ion homeostasis and autophagic flux.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 11559-11564 (2013).</li><li>McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+incorporating+macromolecules+into+adherent+cells.">A method for incorporating macromolecules into adherent cells.</a> The Journal of Cell Biology. 98, 1556-1564 (1984).</li><li>Lafon, M., Lafage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+activity+of+monoclonal+antibodies+specific+for+the+internal+proteins+N+and+NS+of+rabies+virus.">Antiviral activity of monoclonal antibodies specific for the internal proteins N and NS of rabies virus.</a> The Journal of General Virology. 68 (Pt. 12), 3113-3123 (1987).</li><li>Kriegler, M. P., Livingston, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+facilitated+microinjection+of+proteins+into+intact+monolayers+of+tissue+culture+cells).">Chemically facilitated microinjection of proteins into intact monolayers of tissue culture cells).</a> Somatic Cell Genetics. 3, 603-610 (1977).</li><li>Nossa, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+abundant+nuclear+factor+poly(ADP-ribose)+polymerase-1+by+Helicobacter+pylori.">Activation of the abundant nuclear factor poly(ADP-ribose) polymerase-1 by Helicobacter pylori.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19998-20003 (2009).</li><li>Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfecting+mammalian+cells:+Optimization+of+critical+parameters+affecting+calcium-phosphate+precipitate+formation.">Transfecting mammalian cells: Optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation.</a> Nucleic Acids Research. 24, 596-601 (1996).</li><li>Winegar, R. A., Phillips, J. W., Youngblom, J. H., Morgan, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Electroporation+Is+a+Highly+Efficient+Method+for+Introducing+Restriction+Endonucleases+into+Cells.">Cell Electroporation Is a Highly Efficient Method for Introducing Restriction Endonucleases into Cells.</a> Mutation Research. 225, 49-53 (1989).</li><li>Cortes, F., Ortiz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+damage+induced+by+restriction+endonucleases+recognizing+thymine-rich+DNA+sequences+in+electroporated+CHO+cells.">Chromosome damage induced by restriction endonucleases recognizing thymine-rich DNA sequences in electroporated CHO cells.</a> International Journal of Radiation Biology. 61, 323-328 (1992).</li><li>Cortes, F., Ortiz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+chromosomal+aberrations+in+the+CHO+mutant+EM9+and+its+parental+line+AA8+by+EcoRI+restriction+endonuclease:+electroporation+experiments.">Induction of chromosomal aberrations in the CHO mutant EM9 and its parental line AA8 by EcoRI restriction endonuclease: electroporation experiments.</a> Mutation Research. 246, 221-226 (1991).</li><li>Baron, S., Poast, J., Rizzo, D., McFarland, E., Kieff, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+antibodies,+DNA,+and+other+macromolecules+into+cells:+a+highly+efficient+method.">Electroporation of antibodies, DNA, and other macromolecules into cells: a highly efficient method.</a> Journal of Immunological Methods. 242, 115-126 (2000).</li><li>Lewis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+edges+toward+clinic+for+both+gene+therapy+and+drug+delivery.">Electroporation edges toward clinic for both gene therapy and drug delivery.</a> Genetic Engineering and Biotechnology News. 17, (1997).</li><li>Kotzamanis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CFTR+expression+from+a+BAC+carrying+the+complete+human+gene+and+associated+regulatory+elements.">CFTR expression from a BAC carrying the complete human gene and associated regulatory elements.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13, 2938-2948 (2009).</li><li>Chakrabarti, R., Wylie, D. E., Schuster, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+monoclonal+antibodies+into+mammalian+cells+by+electroporation.">Transfer of monoclonal antibodies into mammalian cells by electroporation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 264, 15494-15500 (1989).</li><li>Graziadei, L., Burfeind, P., Bar-Sagi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+unlabeled+proteins+into+living+cells+by+electroporation+and+isolation+of+viable+protein-loaded+cells+using+dextran-fluorescein+isothiocyanate+as+a+marker+for+protein+uptake.">Introduction of unlabeled proteins into living cells by electroporation and isolation of viable protein-loaded cells using dextran-fluorescein isothiocyanate as a marker for protein uptake.</a> Analytical Biochemistry. 194, 198-203 (1991).</li><li>Wilson, A. K., Horwitz, J., De Lanerolle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+electroinjection+method+for+introducing+proteins+into+living+cells.">Evaluation of the electroinjection method for introducing proteins into living cells.</a> The American Journal of Physiology. 260, C355-C363 (1991).</li><li>Prasanna, G. L., Panda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation:+Basic+principles,+practical+considerations+and+applications+in+molecular+biology.">Electroporation: Basic principles, practical considerations and applications in molecular biology.</a> Bioprocess Engineering. 16, 261-264 (1997).</li><li>Weaver, J. C., Chizmadzhev, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+electroporation:+A+review.">Theory of electroporation: A review.</a> Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 41, 135-160 (1996).</li><li>Weaver, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+theory.+Concepts+and+mechanisms.">Electroporation theory. Concepts and mechanisms.</a> Methods in Molecular Biology. 55, 3-28 (1995).</li><li>McAteer, J. A., Douglas, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolayer+culture+techniques.">Monolayer culture techniques.</a> Methods in Enzymology. 58, 132-140 (1979).</li><li>Ho, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+GtgE,+a+novel+virulence+factor+encoded+on+the+Gifsy-2+bacteriophage+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium.">Identification of GtgE, a novel virulence factor encoded on the Gifsy-2 bacteriophage of Salmonella enterica serovar Typhimurium.</a> Journal of Bacteriology. 184, 5234-5239 (2002).</li><li>Niemann, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+novel+secreted+virulence+factors+from+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+by+proteomic+analysis+of+culture+supernatants.">Discovery of novel secreted virulence factors from Salmonella enterica serovar Typhimurium by proteomic analysis of culture supernatants.</a> Infection and Immunity. 79, 33-43 (2011).</li><li>Spano, S., Liu, X., Galan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+targeting+of+Rab29+by+an+effector+protein+distinguishes+the+intracellular+compartments+of+human-adapted+and+broad-host+Salmonella.">Proteolytic targeting of Rab29 by an effector protein distinguishes the intracellular compartments of human-adapted and broad-host Salmonella.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 18418-18423 (2011).</li><li>Haraga, A., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Salmonella+type+III+secretion+effector+interacts+with+the+mammalian+serine/threonine+protein+kinase+PKN1.">A Salmonella type III secretion effector interacts with the mammalian serine/threonine protein kinase PKN1.</a> Cellular Microbiology. 8, 837-846 (2006).</li><li>Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+colocalization+analysis+of+confocal+fluorescence+microscopy+images.">Quantitative colocalization analysis of confocal fluorescence microscopy images.</a> Current Protocols in Cell Biology / Editorial Board, Juan S. Bonifacino ... [et al]. 4 (Unit 4.19), (2011).</li><li>Kimple, M. E., Sondek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+affinity+tags+for+protein+purification.">Overview of affinity tags for protein purification.</a> Current Protocols in Protein Science / Editorial Board, John E. Coligan ... [et al]. 9 (Unit 9.9), (2004).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

وقد تطورت المستجيبات يفرز من البكتيريا المسببة للأمراض على العمل ضمن بيئة الخلية المضيفة، وبالتالي فإنه من المفيد لدراستها في الموقع الطبيعي داخل المضيف. إدخال مؤثرات محددة من الفائدة في الخلايا المضيفة تسمح للتفاعلات الممرض في استضافة ذات الصلة لدراستها في ع...

العديد من الجراثيم سلبية الغرام تستخدم أنظمة إفراز المتخصصة لحقن البروتينات المرتبطة الفوعة (ويشار إلى المستجيبات) مباشرة في الخلايا المضيفة 1-5. هذه المؤثرات لديها مجموعة واسعة من الوظائف البيولوجية بما في ذلك: قمع الحصانة المضيف، والتغيرات هيكل الخلية، وتعديل الاتجار داخل الخلايا والإشارات، والتغيرات النسخي، والتعديلات proteasome والمضيف 6-9. ومن المعروف وظائف بعض المؤثرات، ولكن الأهداف المضيفة وعمل الكيمياء الحيوية (ق) من كثيرين آخرين لا تزال يحدد لاحقا. في حين المقارنة بين النوع البري والالتهابات البكتيرية المؤتلف هو نهج صحيح لدراسة آليات المستجيب الفوعة داخل الخلايا، غالبا ما يكون من المفيد أن استحداث المستجيب الفردي في الخلية المضيفة. وهكذا، طرق بسيطة لإدخال وتميز البروتينات المستجيب البكتيرية في سياق الخلايا المضيفة أمر مرغوب فيه للغاية. تبسيط التحليل واي تجريبيعشر على المستجيب واحد أمر بالغ الأهمية كما المستجيبات أخرى قد يكون لها وظائف معارضة أو زائدة عن الحاجة. لإنجاز هذا التبسيط، وأدخلت الباحثين سابقا الجزيئات إلى الخلايا عن طريق العديد من الطرق المختلفة، بما في ذلك تنبيغ الفيروسية 10، حقن مكروي 11، كشط تحميل 12،13، والانصهار مع خلية يسببها كيميائيا حقن مكروي 14 والبروتين الملكية &quot;ترنسفكأيشن&quot; الكواشف 15، رواسب فوسفات الكالسيوم 16، و electroporation 17-20. وتتراوح جزيئات عرض من الأحماض النووية بما في ذلك الأنواع DNA، RNA، ورني للبروتينات، والأصباغ خلايا كتيمة، والأجسام المضادة لأهداف داخل الخلايا 21،22. بعض الطرائق حدودها بما في ذلك نوع من جزيء التي يمكن إدخالها، ويمكن أن تكون خاصة التحليلات المصب محدودة نظرا لسمية عالية الخلوية، وآليات الضارة للعمل، فعالية منخفضة، أو الكفاءة المقدمة. ترنسفكأيشن، وهو ofteطريقة ن استخدامها للتعبير عن الجينات البكتيرية في خلايا الثدييات، كما يعاني القيد أن بعض أنواع الخلايا المضيفة ذات الصلة، مثل الضامة والخلايا الأولية، هي مقاومة وخاصة تجاه ترنسفكأيشن. أبعد من ذلك، فمن الصعب السيطرة على مستويات البروتين البكتيري تنتج على إدخال DNA الأجانب. وقد أنشأت الكثير من العمل Electroporation للمن الأحماض النووية في خلايا الثدييات على حد سواء البكتيرية وكأسلوب مختبر مشترك؛ ومع ذلك، هناك أبحاث جارية حول أفضل الطرق لتقديم البروتينات في الخلايا تحت الظروف الفسيولوجية. هي تقارير عن البروتين ترنسفكأيشن واعدة، ولكن تتطلب الكواشف مكلفة والتحسين. الرغبة في إدخال المستجيبات البكتيرية السامة إلى مجموعة واسعة من الأهداف خلية بأقل تكلفة ممكنة أدى بنا إلى النظر في Electroporation للكطريقة لدراسة هذه البروتينات في الجسم الحي. بروتين 23-25 ​​Electroporation للهو الوفاءهود لإدخال البروتينات في الخلايا الحية عبر electropermeabilization، المعروف أيضا باسم الكهربائية ترنسفكأيشن أو الكهربائية حقن 26. وتستخدم هذه التقنية عالية الكثافة النبضات الكهربائية لخلق المسام في أغشية الخلايا. هذه المسام عكسها تسمح الجزيئات التي يتم استبعادها عادة من الفضاء داخل الخلايا لدخول الخلية. على إزالة الحقل الكهربائي الخارجي، لا يمكن للغشاء إعادة الختم، والسماح للخلية للاحتفاظ الجزيئات التي مرت من خلال المسام 27،28. تم استخدام electroporator القياسية في هذه الدراسة لتقديم باستمرار المستجيبات البكتيرية في كل من الماوس خلايا تشبه البلاعم والخلايا الظهارية الإنسان. طريقة سريعة وفعالة، وغير مكلفة، مع أي انخفاض ملموس في جدوى الخلوية. يمكن تصور البروتينات أدخلت عن طريق المناعي المجهري أو استخدامها لالمقايسات الفنية. وقد تجلى ذلك باستخدام بروتين الفلورية الخضراء (GFP) كمعيار غير سامة، وكذلكاثنين من السالمونيلا البروتينات المستجيب، SspH1 وGtgE. نقترح البروتين Electroporation للكأداة إضافية في جعبته لدراسة البروتينات الفوعة البكتيرية وظائفهم في الخلايا المضيفة حقيقية النواة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1132">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:532px;">Material or Equipment</td>
			<td style="width:177px;">Company</td>
			<td style="width:108px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:315px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.25% Trypsin-EDTA Solution</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-050-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.4cm Gap-disposable electroporation cuvettes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>165-2088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100% Methanol</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Flammable, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4919</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell Counting Apparatus - Hemocytometer or Coulter Counter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Model Z1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Cell Culture Incubator</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Humidified 95% air/5% CO2 atmosphere at 37 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell Culture Plastic</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Cell culture flasks/plates, pipets, tubes, rubber policeman</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#8217;s Medium (DMEM)</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-013</td>
			<td>Warm to 37 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Electroporator</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>E. coli Pulser</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>35-016-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescent confocal microscope&#160;</td>
			<td>Ziess</td>
			<td>Model&#160; LSM 710&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass Bottom Dishes for Microscopy</td>
			<td>Wilco Wells</td>
			<td>HBSt-3522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HALT Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Pierce</td>
			<td align="right">78430</td>
			<td>Corrosive, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HeLa Cell Line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LDS 4X Loading Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Minimal Essential Medium (MEM)&#160;</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-010</td>
			<td>Warm to 37 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Other fluorescent stains (WGA, DAPI) in conjunction with anti-fade reagent</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RAW 264.7 Cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primary Antibody Against Target of Interest</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Secondary Antibody Conjugated to Fluorophore</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Chill to 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Warm to 37 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin Agarose Resin Suspension&#160;</td>
			<td>Pierce</td>
			<td align="right">20353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Table Top Centrifuge Capable of Accepting Conical Tubes (swinging bucket preferred)</td>
			<td>Any</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TCEP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">646547</td>
			<td>Corrosive, Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8585</td>
			<td>Irritant, Toxic</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroporation of functional bacterial effectors into mammalian cells

دراسة التفاعلات البروتين في سياق الخلايا الحية يمكن أن تولد المعلومات الهامة حول توطين والديناميكية وشركاء التفاعل. هذه المعلومات هي قيمة خاصة في سياق التفاعلات المضيف الممرض. العديد من البروتينات الممرض تعمل داخل الخلايا المضيفة في مجموعة متنوعة من طريقة مثل، مما يتيح التهرب من الجهاز المناعي المضيفة والبقاء على قيد الحياة في البيئة داخل الخلايا. لدراسة هذه الممرض البروتين التفاعلات الخلية المضيفة، وتستخدم عدة نهج شيوعا، بما في ذلك: في إصابة الجسم الحي مع سلالة التعبير عن بروتين الموسومة أو متحولة، أو إدخال جينات الممرض عبر ترنسفكأيشن أو تنبيغ. كل من هذه الطرق لها مزايا وعيوب. سعينا وسيلة لإدخال مباشرة البروتينات الخارجية إلى داخل الخلايا. يستخدم Electroporation للعادة لتقديم الأحماض النووية في خلايا، ولكن تم أكثر نادرا ما تطبق على البروتينات على الرغم من أن أساس فيزيائي حيوي هو نفسه تماما.تم استخدام electroporator القياسية لإدخال مؤثرات تقارب الموسومة البكتيرية إلى خلايا الثدييات. كان المثقف خلايا البلاعم الظهارية والفأر الإنسان من خلال الطرق التقليدية، فصل، ووضعها في 0.4 سم cuvettes الفجوة Electroporation للمع البروتين البكتيري الممرض خارجي من الفائدة (على سبيل المثال السالمونيلا التيفية الفأرية GtgE). بعد Electroporation لل(0.3 كيلو فولت) والقصيرة (4 ساعات) فترة نقاهة، تم التحقق من البروتين داخل الخلايا التي وصفها fluorescently البروتين عن طريق بطاقة تقارب ودراسة التوزيع المكاني والزماني بواسطة المجهر متحد البؤر. وقد تبين أن البروتين electroporated أيضا لتكون وظيفية داخل الخلية وقادرة على الاتجار التحت خلوية الصحيح والتفاعل البروتين البروتين. في حين تميل البروتينات الخارجية لتتراكم على سطح الخلايا، فان عينات electroporated زيادات كبيرة في داخل الخلايا تركيز المستجيب نسبة إلى الحضانة وحدها. بروتوكول بسيط وسريع بما فيه الكفاية مما يتعين القيام به في ا ف بالأزياء arallel، والسماح لتوصيف عالية الإنتاجية للبروتينات الممرض في الخلايا المضيفة بما في ذلك استهداف التحت خلوية وظيفة البروتينات الفوعة.

كما دليلا الأولي للمفهوم، وقدم النقى البروتين الفلوري الأخضر بنجاح في خلايا الثدييات باستخدام Electroporation لل. هو عرض GFP، تقريبي 27 دينار كويتي بروتين الوزن الجزيئي عادة في خلايا الثدييات (معبرا عادة من DNA البلازميد) كأداة البيولوجيا الجزيئية الخلوية دون سمية كبيرة. وحضنت...

Watch this Scientific Journal Video about Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells at JoVE.com

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.

Electroporation للمن المستجيبات البكتيرية وظيفية في خلايا الثدييات

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

electroporation-of-functional-bacterial-effectors-into-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.0K Views.  Pacific Northwest National Laboratory. Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells. 

Video: Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be applied to the study of cell invasion by virtually any culturable bacterium. The stages at which specific aspects of invasion can be studied, such as the role of actin rearrangement or caveolae, will be highlighted. Host cells are grown in flasks and when ready for use are seeded into 24-well plates containing Thermanox coverslips. Using coverslips allows subsequent removal of the cells from the wells to reduce interference from serum proteins deposited onto the sides of the wells (to which S. aureus would attach). Bacteria are grown to the required density and washed to remove any secreted proteins (e.g. toxins). Coverslips with confluent layers of endothelial cells are transferred to new 24-well plates containing fresh culture medium before the addition of bacteria. Bacteria and cells are then incubated together for the required amount of time in 5% CO2 at 37&deg;C. For S. aureus this is typically between 15-90 minutes. Thermanox coverslips are removed from each well and dip-washed in PBS to remove unattached bacteria. If total associated bacteria (adherent and internalised) are to be quantified, coverslips are then placed in a fresh well containing 0.5% Triton X-100 in PBS. Gentle pipetting leads to complete cell lysis and bacteria are enumerated by serial dilution and plating onto agar. If the number of bacteria that have invaded the cells is needed, coverslips are added to wells containing 500 &mu;l tissue culture medium supplemented with gentamicin and incubation continued for 1 h, which will kill all external bacteria. Coverslips can then be washed, cells lysed and bacteria enumerated by plating onto agar as described above. If the experiment requires direct visualisation, coverslips can be fixed and stained for light, fluorescence or confocal microscopy or prepared for electron microscopy.

A general protocol for the study of invasion of host cells by a bacterial pathogen, focusing on Staphylococcus aureus and human endothelial cells.

غزو ​​الخلايا البشرية من قبل الممرض الجرثومي

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

الفحص في المختبر من الالتصاق الجرثومي على الخلايا الظهارية الثدييات

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

عزل خلايا المناعة وظيفية القلب

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

التصوير في الوقت الحقيقي من خلايا الدم النخاعي في ديناميات<em&gt; APC<sup&gt; مين / +</sup</em&gt; الأورام المعوية التي كتبها غزل القرص متحد البؤر المجهر

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.

Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.

كشف الجليكوجين في خلايا الدم المحيطي وحيدات النوى مع الدوري حمض شيف تلطيخ

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

جيل ومتعدد المظهري فحص عالية المحتوى من<em&gt; الكوكسيلا البورنيتية</em&gt; المسوخ ينقول

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of &gt;10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.

Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

بكتيريا الاصطناعية الكروموسومات: أداة علم الجينوم وظيفية لدراسة الفيروسات RNA إيجابي حبلا

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate immune system responses during the course of infection. Though methods have been developed to successfully purify and produce many of these important virulence factors, there are still many bacterial toxins whose unique structure or extensive post-translational modifications make them difficult to purify and study in in vitro systems. Furthermore, even when pure toxin can be obtained, there are many challenges associated with studying the specific effects of a toxin under relevant physiological conditions. Most in vitro cell culture models designed to assess the effects of secreted bacterial toxins on host cells involve incubating host cells with a one-time dose of toxin. Such methods poorly approximate what host cells actually experience during an infection, where toxin is continually produced by bacterial cells and allowed to accumulate gradually during the course of infection. This protocol describes the design of a permeable membrane insert-based bacterial infection system to study the effects of Streptolysin S, a potent toxin produced by Group A Streptococcus, on human epithelial keratinocytes. This system more closely mimics the natural physiological environment during an infection than methods where pure toxin or bacterial supernatants are directly applied to host cells. Importantly, this method also eliminates the bias of host responses that are due to direct contact between the bacteria and host cells. This system has been utilized to effectively assess the effects of Streptolysin S (SLS) on host membrane integrity, cellular viability, and cellular signaling responses. This technique can be readily applied to the study of other secreted virulence factors on a variety of mammalian host cell types to investigate the specific role of a secreted bacterial factor during the course of infection.

Here, a method using a permeable membrane insert-based infection system to study the effects of Streptolysin S, a secreted toxin produced by Group A Streptococcus, on keratinocytes is described. This system can be readily applied to the study of other secreted bacterial proteins on various host cell types during infection.

تنفيذ نظام العدوى أساس إدراج-نافذ غشاء لدراسة آثار يفرز البكتيرية السموم على خلايا المضيف الثدييات

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria have evolved different strategies to manipulate their host metabolism for their own benefit. This bacterial manipulation is often coupled with severe symptom development or the death of the affected plants. Determining the specific bacterial molecules responsible for the host manipulation has become an important field in microbiological research. After the identification of these bacterial molecules, called &#34;effectors,&#34; it is important to elucidate their function. A straightforward approach to determine the function of an effector is to identify its proteinaceous binding partner in its natural host via a yeast two-hybrid (Y2H) screen. Normally the host harbors numerous potential binding partners that cannot be predicted sufficiently by any in silico algorithm. It is thus the best choice to perform a screen with the hypothetical effector against a whole library of expressed host proteins. It is especially challenging if the causative agent is uncultivable like phytoplasma. This protocol provides step-by-step instructions for DNA purification from a phytoplasma-infected woody host plant, the amplification of the potential effector, and the subsequent identification of the plant&#39;s molecular interaction partner with a Y2H screen. Even though Y2H screens are commonly used, there is a trend to outsource this technique to biotech companies that offer the Y2H service at a cost. This protocol provides instructions on how to perform a Y2H in any decently equipped molecular biology laboratory using standard lab techniques.

Bacterial effector proteins are important for establishing successful infections. This protocol describes the experimental identification of proteinaceous binding partners of a bacterial effector protein in its natural plant host. Identifying these effector interactions via yeast two-hybrid screens has become an important tool in unravelling molecular pathogenicity strategies.

التكشف وظيفة من المستجيب البكتيرية من مسببات الأمراض النباتية غير الصالحة للزراعة باستخدام الخميرة شاشة ثنائية مختلطة

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of infected cells, including organelle ultrastructure, cytoskeletal network organization, as well as cellular processes such as Stress Granule (SG) formation. The characterization of how pathogens subvert host processes is an important and integral part of the field of pathogenesis. While variable phenotypes may be readily visible, the precise analysis of the qualitative and quantitative differences in the cellular structures induced by pathogen challenge is essential for defining statistically significant differences between experimental and control samples. SG formation is an evolutionarily conserved stress response that leads to antiviral responses and has long been investigated using viral infections1. SG formation also affects signaling cascades and may have other still unknown consequences2. The characterization of this stress response to pathogens other than viruses, such as bacterial pathogens, is currently an emerging area of research3. For now, quantitative and qualitative analysis of SG formation is not yet routinely used, even in the viral systems. Here we describe a simple method for inducing and characterizing SG formation in uninfected cells and in cells infected with a cytosolic bacterial pathogen, which affects the formation of SGs in response to various exogenous stresses. Analysis of SG formation and composition is achieved by using a number of different SG markers and the spot detector plug-in of ICY, an open source image analysis tool.

We describe a method for the qualitative and quantitative analysis of stress granule formation in mammalian cells after the cells are challenged with bacteria and a number of different stresses. This protocol can be applied to investigate the cellular stress granule response in a wide range of host-bacterial interactions.

تحليل المناعي من الإجهاد الحبيبية تشكيل بعد تحدي البكتيريا من خلايا الثدييات

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...